Bewertung abnormer wachstumsbezogener Gene von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen durch Kombination der CRISPR/Cas9-Technologie mit der Zellzählung

Der Forschungsschwerpunkt ist die Pathogenese der Leukämie. Unser Ziel ist es, durch die Kombination mit CRISPR/Cas9 mit CCK-8-Assays Gene zu identifizieren, die für die abnormale HSPC-Proliferation entscheidend sind, um ihre Rolle bei der Tumorogenese und das Potenzial als Angriffspunkte für Medikamente aufzuzeigen.

Die CRISPR/Cas-9-basierte Geneditierung bietet einen einfachen und effizienten Ansatz, um einen Gen-Knockout in Ihren eukaryotischen Zellen zu erreichen. Die aktuelle experimentelle Herausforderung besteht darin, die CRISPR/Cas-9-Knockout-Effizienz weiter zu erhöhen.

Unser Protokoll verwendet Cas-9-Mäuse, um Knochenmarkzellen mit beratender Cas-9-Expression zu versorgen, wodurch virale SGIs in die Zellen abgegeben werden, wodurch die experimentelle Effizienz erheblich verbessert wird.

[Moderator] Zu Beginn entnehmen Sie den Oberschenkelknochen und das Schienbein von der euthanasierten Versuchsmaus. Übertragen Sie den Oberschenkelknochen und das Schienbein sofort nach der Entnahme in eine Laminar-Flow-Haube, um die Sterilität zu erhalten. Spülen Sie die Knochenmarkhöhle mit einer sterilen Ein-Milliliter-Spritze mit PBS, das 2 % FBS enthält, um Knochenmarkzellen zu sammeln. Pipettieren Sie die Knochenmarkzellen 30 bis 50 Mal auf und ab, um sie in einzelne Zellen zu verteilen. Übertragen Sie die Zellmischung in ein 50-Milliliter-Röhrchen und wirbeln Sie sie gut durch. Geben Sie 10 Mikroliter der Zellsuspension zu 40 Mikrolitern Erythrozyten-Lysepuffer und legen Sie es fünf Minuten lang auf Eis, um die Erythrozyten zu lysieren. Fügen Sie dann 50 Mikroliter Trypanblau-Lösung hinzu. Gut mischen und lebensfähige Zellen zählen. Anschließend zentrifugieren Sie die Zellen bei 800 G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius und aspirieren den Überstand. Dann resuspendieren Sie die Zellen in einer Konzentration von ein- bis zweimal 10 hoch sechs Zellen pro Milliliter im Knochenmark, Vorstimulationsmedium. Und säen Sie 10 Milliliter der Suspension in eine 10-Zentimeter-Schale. Inkubieren Sie das Gericht 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Um die vorstimulierten Zellen am nächsten Tag zu sammeln, fügen Sie fünf bis 10 Milliliter PBS mit 2 % FBS hinzu und spülen Sie die Platte kräftig aus. Übertragen Sie die Zellen in ein frisches Röhrchen und fügen Sie den Zellen Trypanblau hinzu. Zählen Sie lebensfähige Zellen in der Mischung. Anschließend zentrifugieren Sie die Zellen bei 800 G für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Nach dem Verwerfen des Überstands werden die Zellen in einer frisch zubereiteten Zündkapsellösung in einer Konzentration von etwa 10 hoch sechs Zellen pro Milliliter wieder suspendiert. Säen Sie vier Milliliter der Suspension in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Platte. Verschließen Sie die Platte mit Parafilm und zentrifugieren Sie sie bei 1.500 g für 90 Minuten bei 32 Grad Celsius. Nach der Zentrifugation die Zellen vorsichtig mit einer Pipette wieder suspendieren, ohne das Medium zu wechseln. Inkubieren Sie die Platte vier bis sechs Stunden lang. Für die erste Transfektion aspirieren Sie etwa drei Milliliter Überstandsmedium aus jeder Vertiefung in ein Röhrchen und fügen Sie ein gleiches Volumen Knochenmark-Vorstimulationsmedium hinzu. Wenn Zellen versehentlich abgesaugt werden, wiederholen Sie die Schritte zum Zentrifugieren und erneuten Aufwirbeln wie zuvor beschrieben. Für die sekundäre Transfektion am nächsten Tag entfernen Sie zwei bis drei Milliliter Medium aus jeder Vertiefung und fügen Sie ein gleiches Volumen frisch aufgetauter retroviraler Stammlösung zusammen mit entsprechenden Mengen Hepas und Polygreen hinzu. Zentrifugieren Sie die Platte bei 1.500 g für 90 Minuten bei 37 Grad Celsius. Nach der Zentrifugation werden die Zellen vorsichtig wieder suspendiert und vier bis sechs Stunden lang inkubiert. Tauschen Sie nun das Medium wie zuvor beschrieben aus und inkubieren Sie es 24 Stunden lang. Waschen Sie die Platte mit PBS mit 2% FBS und sammeln Sie die Zellen. Filtrieren Sie die Zellen durch ein 70-Mikrometer-Sieb, bevor Sie die lebensfähigen Zellen mit Trypanblau zählen. Anschließend zentrifugieren Sie die Zellen bei 800 G für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Resuspendieren Sie die Zellen in DMEM, die 10% FBS und murines Interleukin-3, Interleukin-6 und Stammzellfaktor enthalten. Zentrifugieren Sie etwa 0,5 bis 1x10 auf die Potenz von sechs Zellen bei 800 G für fünf Minuten und verwerfen Sie den Überstand. Lagern Sie das Zellpellet bei -80 Grad Celsius für die genomische DNA-Extraktion. Addieren Sie nun 1x10 zur Leistung von vier Zellen pro Vertiefung in eine 96-Well-Platte, wodurch sechs Vertiefungen pro Gruppe repliziert werden. Geben Sie dann 100 Mikroliter steriles PBS in die umliegenden Vertiefungen und inkubieren Sie bis zu verschiedenen Zeitpunkten von 0, 24, 48 und 72 Stunden. Aspirieren Sie das Medium zu jedem Zeitpunkt und geben Sie 110 Mikroliter Medium mit 1/10 Volumen CCK-8-Lösung in die Vertiefungen. Inkubieren Sie die Mischung eine Stunde lang. Messen Sie abschließend die Extinktion bei 450 Nanometern mit einem Mikroplatten-Spektralphotometer. Der Trp53-Knockout erhöhte signifikant die proliferative Kapazität von Maus-, hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen im Vergleich zu Kontrollen nach 24, 48 und 72 Stunden, gemessen mit dem CCK-8-Assay. Die Editiereffizienz von Trp53 wurde unter Verwendung der TIDE-Analyse auf 7,3 % geschätzt. Und die Sequenzierung der nächsten Generation deckte Mutationen auf, die an verschiedenen Positionen im Gen auftreten.