Erfassung häufiger fragiler Stellenbrüche durch natives γH2A. X ChIP

Unser Luxus konzentriert sich auf den Verlust der Dating, die Rolle der häufigen Instabilität der fragilen Stelle im Jive bei der Tumorregenese. Versuchen Sie, virale Mobilitäten in onkogenen Gyron Krebszellen zu identifizieren, die therapeutisch genutzt werden können. Ansonsten ermöglichen die Bildgebung und die Sequenzierungstechnologien, wie z. B. Einzelzellsympathie und Lebendzellbildgebung, eine hochauflösende Kartierung der genomischen Instabilität in der Masse.

Die Region in vivo-Modelle, einschließlich Rauschen, gentechnisch veränderte Mausmodelle und CRISPR-Basissysteme um uns herum, um die Mechanismen der genomischen Instabilität von Onkogenen im Detail zu untersuchen. Das langfristige Interesse unseres Labors besteht darin, spezifische Schwachstellen in Krebszellen zu identifizieren, die strategisch für infizierte Behandlungen behandelt werden können, wobei der Schwerpunkt auf der Minimierung der Schädigung normaler Zellen liegt. Dazu gehört auch die Erforschung genetischer und epigenetischer Schwachstellen, um normale therapeutische Möglichkeiten aufzudecken.

Behandeln Sie die HEK 293 T-Zellen zunächst 24 Stunden lang mit DMSO, Ethyldecolin und Hydroxyharnstoff in drei verschiedenen Platten. Nachdem Sie die Zellen zweimal mit PBS gewaschen haben, zentrifugieren Sie sie bei 500 G vier, fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Suspendieren Sie das Pellet wieder in 500 Mikrolitern frisch zubereitetem kaltem Puffer A und inkubieren Sie es fünf bis 10 Minuten lang auf Eis.

Beobachten Sie den Lyseverlauf unter einem Lichtmikroskop, um die vollständige Zelllyse zu bestätigen. Nach der Lyse zentrifugieren Sie die Zellsuspension fünf Minuten lang bei 500 g bei vier Grad Celsius und resuspendieren Sie das Kernpellet in 500 Mikrolitern kaltem Puffer A. Zentrifugieren Sie erneut und resuspendieren Sie die intakten Kerne mit 100 Mikrolitern Mikrokokken-Nukleasepuffer, indem Sie fünf- bis zehnmal pipettieren. Geben Sie sofort die vorgegebene Menge an Mikrokokken-Nuklease zu den Proben.

Legen Sie die Röhren für fünf Minuten bei 37 Grad Celsius auf einen Rotator. Stellen Sie die Röhrchen sofort wieder auf Eis und fügen Sie EDTA hinzu, um den Aufschluss zu beenden. Nach dem Vortexen 500 Mikroliter Puffer B zugeben und zum Mischen auf und ab pipettieren.

Inkubieren Sie das Röhrchen fünf Minuten lang auf Eis, um die Proteine zu lösen. Um das unlösliche Material zu pelletieren, zentrifugieren Sie die Proben fünf Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit bei vier Grad Celsius. Der klare Überstand wird in neue 1,5-Milliliter-Röhrchen überführt, die als native Chromatinfraktion gekennzeichnet sind.

Um die Chromatinfragmentierung zu überprüfen, aliquotieren Sie 10 Mikroliter des Überstands in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen. Mischen Sie den Überstand mit 20 Mikrolitern destilliertem Wasser und 30 Mikrolitern Phenolchloroform-Isoamylalkohol. Nach kräftigem Vortexen zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 20.000 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius und beobachten Sie drei verschiedene Schichten: eine klare obere Schicht, eine weiße mittlere Schicht und eine gelbe untere Schicht.

Übertragen Sie vorsichtig 20 Mikroliter der oberen wässrigen Phase, die DNA enthält, in ein frisches Röhrchen. Trennen Sie die gereinigte DNA 30 Minuten lang bei 100 Volt in einem 1,5%igen Agarose-Gel. Visualisieren Sie die Aufschlussmuster, um sicherzustellen, dass die Größe der Chromatinfragmente hauptsächlich zwischen 200 und 1.000 Basenpaaren liegt.

Übertragen Sie 20 Mikroliter verdautes Chromatin in jedes Röhrchen, das 180 Mikroliter Elutionspuffer enthält. Beschriften Sie die Röhrchen als Eingabeproben und lagern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius. Geben Sie 400 Mikroliter verdautes Chromatin in ein weiteres 1,5-Milliliter-Röhrchen für die Chromatin-Immunpräzipitation oder den Chip.

Übertragen Sie den Gamma-H2-AX-Antikörper auf eine mit DMSO, Ethyldecolin behandelte und mit Hydroxyharnstoff behandelte Probe. Legen Sie die Röhren fünf Stunden lang oder am besten über Nacht bei vier Grad Celsius auf einen Rotator. In der Zwischenzeit werden mit Hilfe von Spitzen mit breiter Öffnung 100 Mikroliter des magnetischen Proteins AG in Chipqualität in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen aliquotiert.

Legen Sie das Röhrchen eine Minute lang auf einen Magnetständer und entsorgen Sie die Flüssigkeit dann vorsichtig. Als nächstes resuspendieren Sie die Kügelchen in einem Milliliter PBS mit 0,5 % BSA. Drehen Sie das Rohr vier Stunden lang bei vier Grad Celsius.

Setzen Sie das Röhrchen für eine Minute wieder auf den Magnetständer und entsorgen Sie den Überstand. Nach dem zweiten Waschen resuspendieren Sie die vorcodierten Kügelchen in 100 Mikrolitern Puffer B. Geben Sie 25 Mikroliter der vorcodierten magnetischen Kügelchensuspension in jedes Chip-Probenröhrchen. Drehen Sie die Röhrchen zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius, legen Sie dann die Chipröhrchen auf einen Magnetständer und warten Sie, bis die Kügelchen an der Seite des Röhrchens haften und die Lösung klar wird.

Entsorgen Sie den durchsichtigen Überstand, ohne die magnetischen Kügelchen zu stören. Die Kügelchen in einem Milliliter Waschpuffer resuspendieren und 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius drehen. Legen Sie die Tuben wieder auf den Magnetständer und warten Sie, bis die Lösung klar ist, bevor Sie den Waschpuffer entsorgen.

Nach der letzten Wäsche zentrifugieren Sie die Röhrchen kurz bei 400 g für 30 Sekunden bei vier Grad Celsius, um Restflüssigkeit zu entfernen. Legen Sie die Röhrchen wieder auf den Magnetständer und entfernen Sie vorsichtig die restliche Flüssigkeit vom Boden des Röhrchens. Nachdem Sie die Pulldown-Effizienz der Chip-Antikörper mit Western Blot überprüft haben, fügen Sie jeder der verbleibenden Chipproben 50 Mikroliter Elutionspuffer hinzu.

Legen Sie die Röhrchen auf einen Therma-Mixer und schütteln Sie sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Legen Sie die Röhrchen für eine Minute auf eine Magnethalterung und sammeln Sie das Eluit in neuen Röhrchen. Geben Sie 100 Mikroliter Elutionspuffer zu jeder Chip-Elutionsprobe und 180 Mikroliter Elutionspuffer zu jeder Eingangsprobe.

Geben Sie dann 200 Mikroliter Phenolchloroform-Isoamylalkohol zu jeder Probe und wirbeln Sie die Röhrchen kräftig durch, um sie zu mischen. Nach dem Zentrifugieren der Proben wird die obere wässrige Schicht vorsichtig in die Röhrchen mit 19 Mikrolitern drei molaren Natriumacetat und zwei Mikrolitern Glykogenlösung übertragen. Mischen Sie, indem Sie die Tuben vortexen.

Fügen Sie jeder Probe 500 Mikroliter 100%iges Ethanol hinzu und wirbeln Sie sie gründlich ein. Legen Sie die Röhrchen zwei Stunden lang oder über Nacht bei minus 20 Grad Celsius, um die DNA auszufällen. Zentrifugieren Sie dann die Röhrchen, bevor Sie den Überstand verwerfen und das Pellet in einem Milliliter 70%igem Ethanol erneut suspendieren.

Sobald das restliche Ethanol durch Zentrifugation entfernt wurde, trocknen Sie die DNA-Pellets zwei bis drei Minuten lang an der Luft, bevor Sie sie in 400 Mikrolitern TE-Puffer wieder suspendieren. Höhere Konzentrationen der Mikrokokken-Nuklease führten zu einem umfangreicheren Verdau des Chromatins, was zu einer Dominanz von Mononukleosomenfragmenten führte. Im Gegensatz dazu war bei niedrigeren Mikrokokken-Nuklease-Konzentrationen die Mehrheit der Chromatinfragmente größer und oft größer als ein Kilo Base.

Die Gamma-H2-AX-Spiegel waren in replikationsgestressten Zellen, die mit Ethyldecolin behandelt wurden, im Vergleich zu DMSO-behandelten Kontrollen signifikant erhöht, wie in den Eingabeproben sowohl für native als auch für vernetzte Chips gezeigt wurde.