Name: Identifizierung funktionell relevanter Lentivirus-Integrationsstellen in einer Insertionsmutagenese-Zellbibliothek (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Lernen Sie die InSET-Methode zur Identifizierung funktioneller Lentivirus-Integrationsstellen in Zellbibliotheken. Dieses Verfahren ermöglicht die Entdeckung neuer genomischer Elemente in bisher unerforschten Regionen des menschlichen Genoms.

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Abbildung 1 bietet einen schematischen Überblick über die InSET-Methode. Für eine optimale Abdeckung bereiten Sie fünf parallele Bibliotheken aus 1 μg genomischer DNA vor und bündeln sie dann für die Sequenzierung der nächsten Generation. Dieses Verfahren wurde in früheren Tests kontinuierlich erfolgreich abgeschlossen, obwohl Benutzer nach eigenem Ermessen Pausenpunkte einführen können. Detaillierte Informationen zu den in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräten finden Sie in der Materialtabelle.
1. Erfassung von Lentivirus-Integrationsstellen im Genom
<ol>
	<li>Verwenden Sie die genomische DNA, die aus einer Lentivirus-basierten Insertionsmutagenese-Zellbibliothek (1 μg) isoliert wurde, wie in einer früheren Studie beschrieben32, als Template für eine lineare PCR in einer 50-μl-Reaktion, die 1x Taq-Puffer, 2,5 U Taq-DNA-Polymerase, 4 μl dNTP-Gemisch (je 2,5 mM) und 0,3 μM biotinylierten Primer 3-LTR_prime (Tabelle 1) in einem PCR-Röhrchen enthält. 
HINWEIS: Der 3-LTR_prime-Primer glüht an der LTR-Region der Lentivirus-Sequenz an. Wenn es bis zur 5'-LTR anneht, enthält das amplifizierte Fragment die flankierende genomische Sequenz. Wenn es auf die 3'-LTR abgleitet, enthält das amplifizierte Fragment eine interne Lentivirussequenz, die nicht mit dem Wirtsgenom abgeglichen werden kann und daher bei der nachgeschalteten Sequenzierungsdatenanalyse herausgefiltert wird. Dieser Primer kann auch modifiziert werden, um sich an andere Arten von Vektoren anzupassen, die zur Erzeugung einer Insertionsmutagenese-Zellbibliothek verwendet werden.</li>
	<li>Führen Sie 50 Zyklen linearer PCR in einem Standard-PCR-Thermocycler durch und fügen Sie zu Beginn und unmittelbar nach 25 Zyklen 2,5 U Taq-DNA-Polymerase hinzu. Die PCR-Bedingungen sind wie folgt: 94 °C für 5 Minuten; 50 Zyklen von 94 °C für 30 s, 55 °C für 30 s und 72 °C für 30 s; 72 °C für 5 min. 
	HINWEIS: Um die Aktivität der Taq-DNA-Polymerase während längerer Reaktionen aufrechtzuerhalten, wird empfohlen, das Enzym sowohl zu Beginn als auch in der Mitte der Reaktion hinzuzufügen.</li>
	<li>Übertragen Sie die PCR-Produkte in ein neues, sauberes 1,5-mL-Zentrifugenröhrchen.</li>
	<li>Mischen Sie die PCR-Produkte gründlich mit 10 μl Biotin-Streptavidin-Magnetkügelchen.</li>
	<li>Die Mischung 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubieren und bei 400 U/min in einem Metallbad schütteln. 
	HINWEIS: Nehmen Sie das Röhrchen heraus, um es alle 15 Minuten gut mit der Pipette zu vermischen.</li>
	<li>Verwende einen magnetischen Ständer, um die Perlen zu sammeln, und entferne dann vorsichtig den Überstand.</li>
	<li>Waschen Sie die Kügelchen 6 Mal mit 300 μl Binde-/Waschpuffer (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,1 % Tween-20) und entsorgen Sie den Überstand.</li>
	<li>Mit 300 μL (65 °C) DNase/RNase-freiem destilliertem Wasser zweimal waschen und den Überstand entsorgen.</li>
	<li>Für die Synthese des zweiten Strangs resuspendieren Sie die Kügelchen in einem 24-μl-Reaktionsvolumen, das 1x Klenow-Fragment-Puffer, 2 μl dNTP-Gemisch (je 2,5 mM) und 6,25 μM P5_N6 Primer (Tabelle 1) in einem PCR-Röhrchen enthält. 
	HINWEIS: Bereiten Sie eine 100 μM Stammlösung P5_N6 Grundierung vor. Der P5_N6 Primer besteht aus einer festen P5-Adaptersequenz am 5'-Ende und einer zufälligen Hexamersequenz am 3'-Ende. Das zufällige Hexamer kann an eine Vielzahl von Zielsequenzen binden und eignet sich daher für die Amplifikation verschiedener DNA-Fragmente, die durch lineare PCR erzeugt wurden.</li>
	<li>Die Mischung bei 15 °C für 20 min in einem PCR-Thermocycler vorinkubieren.</li>
	<li>Fügen Sie 2 U Klenow-Fragment (E.coli-DNA-Polymerase mit großem Fragment) hinzu.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Mischungen in einem PCR-Thermocycler unter folgenden Bedingungen: langsam auf 0,5 °C/min von 15 °C auf 25 °C hochfahren, gefolgt von einer 30-minütigen Inkubation; dann langsam auf 0,5 °C/min auf 37 °C hochfahren, gefolgt von einer 1-stündigen Inkubation.</li>
	<li>Übertragen Sie die PCR-Produkte in ein neues, sauberes 1,5-mL-Zentrifugenröhrchen.</li>
	<li>Verwenden Sie einen magnetischen Ständer, um die Kügelchen einzufangen, und entsorgen Sie dann den Überstand.</li>
	<li>Waschen Sie die Kügelchen vorsichtig mit 300 μl 4 °C DNase/RNase-freiem destilliertem Wasser. Sammle die Perlen ein und wirf den Überstand weg.</li>
</ol>
2. Aufbau einer NGS-Bibliothek mit verschachtelter PCR
<ol>
	<li>Resuspendieren Sie die Beads aus Schritt 1.15 in einem 25 μl PCR-Reaktionsvolumen, das 1x Taq-Puffer, 1,25 U Taq-DNA-Polymerase, 0,5 μM Primer P5 (Tabelle 1), 2 μl dNTP-Gemisch (je 2,5 mM) und 0,5 μM Primer 3-LTR_Nest (Tabelle 1) in einem PCR-Röhrchen enthält.</li>
	<li>PCR-Reaktionen in einem PCR-Thermocycler werden unter folgenden Bedingungen durchgeführt: 94 °C für 3 Minuten; 20 Zyklen à 94 μC für 30 s, 55 ΰC für 30 s und 72 ΰC für 30 s; 72 ΰC für 7 Minuten.</li>
	<li>Verwenden Sie 5 μl der PCR-Produkte aus Schritt 2.2 als Template für die nächste PCR-Runde in einem Volumen von 50 μl, das 1x Taq-Puffer, 2,5 U Taq-DNA-Polymerase, 4 μl dNTP-Gemisch (je 2,5 mM), 0,4 μM Primer Illumina_P5 (Tabelle 1) und 0,4 μM Primer Illumina_P7-3 l (Tabelle 1) enthält.</li>
	<li>PCR-Reaktionen in einem PCR-Thermocycler werden unter folgenden Bedingungen durchgeführt: 94 °C für 3 Minuten; 15 Zyklen à 94 μC für 30 s, 55 ΰC für 30 s und 72 ΰC für 30 s; 72 °C für 7 Minuten.</li>
	<li>Übertragen Sie die PCR-Produkte in ein sauberes 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen. 
	HINWEIS: Das Protokoll kann in diesem Schritt pausiert werden, und die Proben können bei -20 °C gelagert werden.</li>
	<li>Aufreinigung der PCR-Produkte mit 1,2-fachen Volumina sauberer DNA-Kügelchen, wodurch das endgültige Volumen auf 21 μl < μl / >
	HINWEIS: Entnehmen Sie 10 μl PCR-Produkte aus jeder der 5 parallel hergestellten Bibliotheken, poolen Sie sie und reinigen Sie sie auf ein Endvolumen von 21 μl. Das Aufreinigungsprotokoll für die PCR-Produkte wurde von den Herstellerangaben für die DNA-Clean-Kügelchen übernommen (siehe Materialtabelle).
	<ol>
		<li>Die Kügelchen 30 min lang von 2-8 °C auf Raumtemperatur äquilibrieren.</li>
		<li>Mischen Sie die Perlen gründlich, indem Sie sie umdrehen oder vortexen.</li>
		<li>Pipettieren Sie das 1,2-fache Volumen der Kügelchen in ein sauberes 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen.</li>
		<li>Geben Sie die PCR-Produkte in die Kügelchen und mischen Sie sie gründlich, indem Sie 10 Mal auf und ab pipettieren.</li>
		<li>5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, um die DNA-Bindung an die Kügelchen zu ermöglichen.</li>
		<li>Legen Sie die Proben auf ein magnetisches Stativ und entfernen Sie den Überstand, sobald die Lösung klar ist (ca. 5 Minuten).</li>
		Zum <li>Waschen der Kügelchen werden 200 μl 80%iges Ethanol zugegeben, 30 s lang bei Raumtemperatur inkubiert und der Überstand entfernt. 
		HINWEIS: Das 80%ige Ethanol sollte frisch zubereitet werden.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 2.6.7 einmal.</li>
		<li>Die Kügelchen bei Raumtemperatur bei geöffnetem Deckel ca. 5 min an der Luft trocknen lassen.</li>
		<li>Nehmen Sie das Röhrchen vom Magnetständer, fügen Sie 22 μl DNase/RNase-freies destilliertes Wasser hinzu, mischen Sie gründlich, indem Sie es 10 Mal auf und ab pipettieren und lassen Sie es 2 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen.</li>
		<li>Stellen Sie das Röhrchen auf das Magnetstativ, bis die Lösung klar ist (ca. 2 min), und geben Sie dann 21 μl Überstand in ein sauberes 1,5 mL Zentrifugenröhrchen. 
		HINWEIS: Das Protokoll kann in diesem Schritt pausiert werden, und die Proben können bei -20 °C gelagert werden.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Verwenden Sie 1 μl gereinigte PCR-Produkte, um die Konzentration mit dem Fluorometer mit dem kommerziell erhältlichen dsDNA-Fluoreszenznachweiskit zu messen (siehe Materialtabelle). 
	HINWEIS: Das Konzentrationsmessprotokoll folgt den Anweisungen des Herstellers für das dsDNA-Nachweiskit.
	<ol>
		<li>Bereiten Sie die Vorbereitung der Arbeitslösung vor, indem Sie das Reagenz und den Puffer (im Kit enthalten) in einem Verhältnis von 1:200 mischen.</li>
		<li>Bereiten Sie die Assay-Standards vor, indem Sie 10 μl Standard #1 und 10 μl Standard #2 (im Kit enthalten) jeweils mit 190 μl Arbeitslösung mischen. Die Mischung 2-3 s lang vorsichtig einrühren.</li>
		<li>Bereiten Sie die Assay-Probe vor, indem Sie 1 μl der gereinigten PCR-Produkte mit 190 μl Arbeitslösung mischen. Die Mischung 2-3 s lang vorsichtig einrühren.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Assay-Standards und Assay-Proben 2 Minuten lang bei Raumtemperatur und schützen Sie sie vor Licht.</li>
		<li>Schalten Sie das Fluorometer ein.</li>
		<li>Wählen Sie das dsDNA-Programm für hohe Empfindlichkeit aus dem Hauptmenü aus.</li>
		<li>Setzen Sie zur Kalibrierung Norm #1 in das Gerät ein, drücken Sie die Taste Norm lesen, um die erste Norm zu messen, setzen Sie dann Norm #2 ein und drücken Sie die Taste Norm lesen, um die zweite Norm zu messen.</li>
		<li>Um eine Stichprobenmessung durchzuführen, klicken Sie auf die Schaltfläche Stichproben ausführen, um zur Seite für die Stichprobenmessung zu gelangen. Führen Sie jedes Röhrchen mit der Assay-Probe ein und drücken Sie die Taste Röhrchen lesen, um die Konzentration zu ermitteln. 
		HINWEIS: Das Protokoll kann in diesem Schritt pausiert werden, und die Proben können bei -20 °C gelagert werden.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Führen Sie NGS auf Illumina-Plattformen mit einer Paired-End-Strategie von 150 bp (PE150) auf einer Skala von 30 Giga-Basis (GB) durch. 
	HINWEIS: Dieser Schritt wird in der Regel an die Sequenzierungsunternehmen ausgelagert.</li>
</ol>
3. Datenanalyse
HINWEIS: Die Analyse in menschlichen Zelllinien wurde in diesem Abschnitt als Beispiel verwendet.
<ol>
	<li>Kartierung von Lentivirus-Integrationsstellen
	<ol>
		<li>Filtern Sie Sequenzier-Reads mit mehr als 50 % minderwertigen Basen (Phred-Score <20), mehr als 15 'N' Basen oder kürzeren als 150 Basen mit fastp tool33 heraus (siehe Materialtabelle).</li>
		<li>Wählen Sie nur Lesevorgänge mit gekoppeltem Ende aus, wobei der Lesevorgang 2 mit dem LTR-Tag "GCCTTGTGTGTGTGTTAGATCCACAG beginnt.
		ATCAAGGATATCTTGTCTTCGTTGGGAGTGAAT 
		TAGCCCTTCCA". 
		HINWEIS: Diese Sequenz hängt von der Sequenz des Vektors ab, der zur Generierung der Insertionsmutagenese-Zellbibliothek verwendet wird.</li>
		<li>Kürzen Sie die LTR-Tag-Sequenz aus den in Schritt 3.1.2 ausgewählten Lesevorgängen.</li>
		<li>Richten Sie die getrimmten Lesevorgänge mit BWA-MEM 34 (siehe Materialtabelle) mit den Standardeinstellungen an der GRCh37/hg19 aus.</li>
		<li>Behalten Sie nur Lesepaare bei, bei denen sowohl Lesevorgang 1 als auch Lesevorgang 2 eindeutig auf das Genom mit korrekter Konfiguration und korrektem Abstand abgebildet sind, angezeigt durch FLAG 147 und FLAG 163.</li>
		<li>Definieren Sie die Einfügeposition als die erste ausgerichtete Basis des getrimmten Lesevorgangs 2.</li>
		<li>Normalisieren Sie die Leseanzahl an jeder eindeutigen Einfügestelle auf die Gesamtzahl der eindeutig ausgerichteten Lesevorgänge in jeder Stichprobe.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Identifizierung von Insertionen, die die zelluläre Fitness beeinflussen (IACFs) 
	HINWEIS: Bei der statistischen Analyse ist es ratsam, paarweise Vergleiche zwischen den drei biologischen Replikaten sowohl der Kontroll- als auch der behandelten Proben durchzuführen, um signifikant angereicherte oder erschöpfte Positionen zu identifizieren. Die oben erwähnte Anzahl von Replikaten ist minimal. Es wird empfohlen, so viele Wiederholungen wie möglich zu verwenden, um die Zuverlässigkeit und Genauigkeit der Ergebnisse zu gewährleisten.
	<ol>
		<li>Konvertieren Sie die normalisierten Lesezahlen jeder Position, um10 Werte zu protokollieren.</li>
		<li>Legen Sie die Logarithmuswerte10 von Positionen mit null Lesevorgängen auf −5 fest.</li>
		<li>Führen Sie einen zweiseitig gekoppelten Student-t-Test für die logarithmischen10-Werte durch.</li>
		<li>Passen Sie die p-Werte für Mehrfachvergleiche mit der Benjamini-Hochberg-Methode in der R-Umgebung an.</li>
		<li>Wählen Sie Positionen mit einem Schwellenwert für die False Discovery Rate (FDR) von 25 % als IACF aus.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Identifizierung von Clustern, die die zelluläre Fitness beeinflussen (CACFs) 
	HINWEIS: Für diese Analyse wurden drei biologische Replikate von Kontroll- und behandelten Proben empfohlen.
	<ol>
		<li>Identifizieren Sie die signifikant angereicherten oder abgereicherten Insertionscluster zwischen Kontroll- und behandelten Proben mit SICER35 (siehe Materialtabelle) mit einem FDR-Schwellenwert von 1%. Der Befehl für die SICER-Analyse lautet "sh $SICER/SICER.sh $InputDir $In $Control $OutputDir hg19 1 10 1 0.8 30 0.01". 
		HINWEIS: Die Bedeutung der Parameter im obigen Befehl ist wie folgt: ["InputDir"] ["behandelte Probeneinfügestellen Bettdatei"] ["Kontrollprobeneinfügestellen Bettdatei"] ["OutputDir"] ["Spezies"] ["Redundanzschwelle"] ["Fenstergröße (bp)"] ["Fragmentgröße"] ["effektive Genomfraktion"] ["Lückengröße (bp)"] ["E-Wert"].</li>
		<li>Rufen Sie Cluster-Regionen ab, die von mindestens zwei biologischen Replikaten gemeinsam genutzt werden, mit der Funktion "intersect" der BEDTools-Suite36 (siehe Materialtabelle) und bezeichnen Sie diese Cluster-Regionen als CACFs.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

InSET: A Novel Tool for Unbiased Genome-Wide Functional Element Discovery

<ol><li>Kapranov, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+transcriptional+activity+in+chromosomes+21+and+22%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Large-scale transcriptional activity in chromosomes 21 and 22.</a> Science. 296 (5569), 916-919 (2002).</li>
<li>Bertone, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+identification+of+human+transcribed+sequences+with+genome+tiling+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global identification of human transcribed sequences with genome tiling arrays.</a> Science. 306 (5705), 2242-2246 (2004).</li>
<li>Carninci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+landscape+of+the+mammalian+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The transcriptional landscape of the mammalian genome.</a> Science. 309 (5740), 1559-1563 (2005).</li>
<li>Kapranov, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+majority+of+total+nuclear-encoded+non-ribosomal+RNA+in+a+human+cell+is+%27dark+matter%27+un-annotated+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">The majority of total nuclear-encoded non-ribosomal RNA in a human cell is 'dark matter' un-annotated RNA.</a> BMC Biol. 8, 149(2010).</li>
<li>Djebali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Landscape+of+transcription+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Landscape of transcription in human cells.</a> Nature. 489 (7414), 101-108 (2012).</li>
<li>Kapranov, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examples+of+the+complex+architecture+of+the+human+transcriptome+revealed+by+race+and+high-density+tiling+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Examples of the complex architecture of the human transcriptome revealed by race and high-density tiling arrays.</a> Genome Res. 15 (7), 987-997 (2005).</li>
<li>Denoeud, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prominent+use+of+distal+5%27+transcription+start+sites+and+discovery+of+a+large+number+of+additional+exons+in+encode+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Prominent use of distal 5' transcription start sites and discovery of a large number of additional exons in encode regions.</a> Genome Res. 17 (6), 746-759 (2007).</li>
<li>Mercer, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+RNA+sequencing+reveals+the+deep+complexity+of+the+human+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Targeted RNA sequencing reveals the deep complexity of the human transcriptome.</a> Nat Biotechnol. 30 (1), 99-104 (2011).</li>
<li>Deveson, I. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+alternative+splicing+of+non-coding+exons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Syst%22%5BJournal%5D)">Universal alternative splicing of non-coding exons.</a> Cell Syst. 6 (2), 245-255.e5 (2018).</li>
<li>Xu, D., Tang, L., Kapranov, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexities+of+mammalian+transcriptome+revealed+by+targeted+RNA+enrichment+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Complexities of mammalian transcriptome revealed by targeted RNA enrichment techniques.</a> Trends Genet. 39 (4), 320-333 (2023).</li>
<li>Amaral, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+status+of+the+human+gene+catalogue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The status of the human gene catalogue.</a> Nature. 622 (7981), 41-47 (2023).</li>
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Die Autoren machen keine Angaben.

In der Vorwärtsgenetik ist das Genom-Walking für die Profilierung von Integrationsstellen in Insertionsmutagenese-Zellbibliotheken unerlässlich. Klassische Genome-Walking-Methoden wie I-PCR und LAM-PCR erfordern häufig einen Restriktionsenzymverdau und eine Ligation, was die Komplexität der Bibliothek reduzieren und zu Verzerrungen aufgrund der Abhängigkeit von der Enzymstelle führen kann 27,28,29. Die InSET-Methode überwindet d...

Die funktionelle Genomik bleibt ein entscheidendes und herausforderndes Gebiet, auch in der Post-Genom-Ära, da ein erheblicher Teil der genomischen Regionen noch nicht funktionell charakterisiert ist. Ein Hauptgrund für diese Herausforderungen liegt in der komplizierten Natur des menschlichen Genoms und Transkriptoms, die durch eine allgegenwärtige Transkription und universelles alternatives Spleißen sowohl in proteinkodierenden als auch in nicht-kodierenden Regionen gekennzeichnet sind1,2,3,4,5. Diese Komplexität wurde durch RNA-gezielte Anreicherungsstudien ausführlich hervorgehoben6,7,8,9. Es wird zunehmend erkannt, dass zahlreiche neuartige genomische Elemente neben den gut annotierten Segmenten des menschlichen Genoms noch nicht kartiert und funktionell nicht annotiert sind10,11,12.
In den letzten Jahren wurden Fortschritte bei Reverse-Genetics-Tools wie RNA-Interferenz (RNAi) und CRISPR/Cas-Systemen erzielt13,14,15,16,17,18,19,20,21. Diese Methoden haben jedoch erhebliche Nachteile, einschließlich unspezifischer Effekte und hoher Kosten im Zusammenhang mit der Generierung komplexer Bibliotheken von kurzen Haarnadel-RNAs (shRNAs) oder Single Guide RNAs (sgRNAs)22,23,24,25. Darüber hinaus konzentrieren sich diese Methoden überwiegend auf annotierte genomische Elemente. Im Gegensatz dazu hat die Vorwärtsgenetik den Vorteil, dass sie neue, unannotierte funktionelle genomische Elemente identifiziert. Angesichts der Komplexität des menschlichen Genoms und Transkriptoms sowie der großen Anzahl neuer genomischer Elemente ist diese Fähigkeit der Vorwärtsgenetik von erheblicher Bedeutung.
Forward Genetics Zellbibliotheken werden häufig durch zufällige retrovirale Integration generiert, was den effizienten Nachweis von genomweiten Integrationsstellen entscheidend für einen Forward Genetics Assay macht. Die Erkennung dieser Integrationsstellen erfordert in der Regel Genom-Walking-Tools26. Obwohl es bei diesen Tools erhebliche Fortschritte gegeben hat, sind nur wenige für Next-Generation-Sequencing-Anwendungen (NGS) optimiert und anschließend in Insertionsmutagenese-Studien eingesetzt. Bei der Insertionsmutagenese in Zelllinien werden häufig Methoden wie die inverse PCR (I-PCR) oder die lineare amplifikationsvermittelte PCR (LAM-PCR) verwendet, um Integrationsstellen zu detektieren27,28,29. Diese Methoden erfordern jedoch in der Regel einen Restriktionsenzymverdau oder Ligationsschritte, die die Effizienz verringern und zu Verzerrungen in den Ergebnissen führen können.
Um die effiziente Detektion genomweiter Integrationsstellen in Vorwärtsgenetik-Screenings zu verbessern, wurde hier eine Methode namens Insertion-based Screen for functional Elements and Transcripts (InSET) Methode eingeführt. Durch die Integration von Genome-Walking mit NGS ermöglicht InSET die Hochdurchsatz-Identifizierung von Lentivirus-Integrationsstellen in Lentivirus-basierten Insertionsmutagenese-Bibliotheken. Im Vergleich zu bestehenden Methoden27,28,29 ist InSET relativ unkompliziert und einfach, da es die Verdau- oder Ligationsschritte des Restriktionsenzyms eliminiert und somit bequemer und zugänglicher wird. Obwohl das bestehende Forward-Genetik-Screening in Säugetierzellen auf sehr wenige haploide oder nahezu haploide Zelllinien beschränkt ist27,28,29,30,31, hat sich InSET in aneuploiden Zelllinien bewährt32.
Diese Studie bietet ein detailliertes, Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Implementierung der InSET-Methode. Darüber hinaus wird die Anwendung von InSET in Insertionsmutagenese-Studien demonstriert. InSET dient als leistungsfähiges Werkzeug zur Identifizierung neuartiger Exons innerhalb genomischer Elemente, die sowohl proteinkodierende als auch nicht-kodierende RNAs in menschlichen Zelllinien umfassen.

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td>Zur Herstellung von Binde-/Waschpuffer</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl (Ph 8,0)</td><td>Invitrogen</td><td>15568025</td><td>Zur Herstellung von Binde-/Waschpuffer</td></tr><tr><td>10-mal; Klenow-Fragment-Puffer&nbsp;</td><td>Takara</td><td>2140A</td><td></td></tr><tr><td>10 mal; Taq Buffer</td><td>Tiangen</td><td>ET101-01-01</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td>Invitrogen</td><td>AM9659</td><td>Zur Herstellung von Binde-/Waschpuffer</td></tr><tr><td>BeaverBeads Streptavidin</td><td>Beaver</td><td>22307-1</td><td>1 &mu; m</td></tr><tr><td>BEDTools</td><td></td><td>Software, v2</td><td>https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/</td></tr> <tr><td>BWA-MEM</td><td></td><td></td><td>Software, v0.7.12</td></tr><tr><td>dNTP Mixture</td><td>Takara</td><td>4030</td><td>je 2,5 mM</td></tr><tr><td>Equalbit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Vazyme</td><td>EQ111-02</td><td></td></tr><tr><td>fastp</td><td></td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td>HiSeq X Ten</td><td>Illumina</td><td>SY-412-1001</td><td>Illumina-Plattform, ausgelagert an Novogene Corporation (Peking)</td></tr><tr><td>Klenow Fragment</td><td>Takara</td><td>2140A</td><td></td></tr><tr><td>NovaSeq 6000</td><td>Illumina</td><td>20012850</td><td>Illumina-Plattform, ausgelagert an Novogene Corporation (Peking)</td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Fluorometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>SICER</td><td></td><td></td><td>Software, v1.1</td></tr><tr><td>Taq DNA Polymerase</td><td>Tiangen</td><td>ET101-01-01</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>HuShi</td><td>30189328</td><td>Zur Herstellung von Binde-/Waschpuffer</td></tr><tr><td>UltraPure Distilled</td><td>Water Invitrogen</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>VAHTS DNA Clean Beads</td><td>Vazyme</td><td>N411-01</td><td></td></tr></tbody></table>

identifizierung funktionell relevanter lentivirus-integrationsstellen in einer insertionsmutagenese-zellbibliothek

Identification of Functionally-Relevant Lentivirus Integration Sites in an Insertional Mutagenesis Cell Library

Das Ausmaß funktioneller Sequenzen innerhalb des menschlichen Genoms ist ein zentrales, aber umstrittenes Thema in der Biologie. Obwohl Hochdurchsatz-Reverse-Gen-Screens bei der Erforschung dieses Themas Fortschritte gemacht haben, beschränken sie ihren Anwendungsbereich oft auf bekannte genomische Elemente und können unspezifische Effekte mit sich bringen. Dies unterstreicht den dringenden Bedarf an neuartigen Werkzeugen für die funktionelle Genomik, die ein tieferes, unvoreingenommenes Verständnis der Genomfunktionalität ermöglichen. Dieses Protokoll führt den Insertion-based Screen for functional Elements and Transcripts (InSET) ein, eine Methode zur Identifizierung von Lentivirus-Integrationsstellen innerhalb einer Lentivirus-basierten Insertionsmutagenese-Zellbibliothek. InSET erleichtert die Erfassung genomweiter lentiviraler Integrationsstellen, wobei Next-Generation-Sequencing zum Nachweis und zur Quantifizierung flankierender Sequenzen eingesetzt wird. Das Design von InSET ermöglicht die Analyse von Variationen der Abundanz an der Integrationsstelle in phänotypischen Screens in großem Maßstab und etabliert es als robustes Werkzeug für die Vorwärtsgenetik und zur Identifizierung funktioneller genomischer Elemente. Ein wesentlicher Vorteil von InSET ist seine Fähigkeit, bisher unidentifizierte genomische Elemente aufzudecken, einschließlich neuartiger funktioneller Exons sowohl proteinkodierender als auch nicht-kodierender RNAs, unabhängig von vorheriger Annotation. Insgesamt ist InSET von großem Wert für die Untersuchung der komplexen Komplexität des menschlichen Genoms und Transkriptoms, bei dem viele genomische Elemente auf ihre funktionelle Charakterisierung warten.

Die Qualitätskontrolle einer NGS-Bibliothek, die in der Regel vom Sequenzierdienstleister durchgeführt wird, dient als Standardprüfung vor der Sequenzierung. Um die Auswirkungen der Bibliotheksqualität zu demonstrieren, wurden zwei Proben verglichen. Die hochwertige Bibliothek, gekennzeichnet als s2-20-15, wurde mit dem standardmäßigen nested PCR-Protokoll hergestellt, das aus zwei aufeinanderfolgenden Amplifikationsschritten besteht: dem ersten mit 20 Zyklen, gefolgt vom zweiten mit 15 Zyklen. Im Gegensatz dazu wurde di...

Insertionsmutagenese ist ein wesentliches Werkzeug in der Vorwärtsgenetik zur Identifizierung funktioneller genomischer Elemente. Hier beschreiben wir den Insertion-based Screen for functional Elements and Transcripts (InSET), eine Methode zum Nachweis von Lentivirus-Integrationsstellen innerhalb einer Lentivirus-basierten Insertionsmutagenese-Zellbibliothek.

Identifizierung funktionell relevanter Lentivirus-Integrationsstellen in einer Insertionsmutagenese-Zellbibliothek

The extent of functional sequences within the human genome is a pivotal yet debated topic in biology. Although high-throughput reverse genetic screens ...

identification-functionally-relevant-lentivirus-integration-sites-an

Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Wir beschreiben ein Protokoll zur Amplifikation retroviraler Integrationsstellen aus der genomischen DNA infizierter Zellen, zur Sequenzierung der amplifizierten Virus-Wirt-Verbindungen und zur anschließenden Kartierung dieser Sequenzen auf ein Referenzgenom. Wir beschreiben auch Techniken zur Quantifizierung der Verteilung von Integrationsstellen relativ zu verschiedenen genomischen Annotationen mit Hilfe von BEDTools.

Amplification, Next-Generation-Sequenzierung und genomischer DNA Mapping von Retrovirale Integration Seiten

Dieses Manuskript beschreibt die experimentelle Prozedur und Softwareanalyse für einen bidirektionalen Integrationsort-Assay, der gleichzeitig stromaufwärts und nachgeschaltete Vektor-Host-Junction-DNA analysieren kann. Bidirektionale PCR-Produkte können für jede nachgeschaltete Sequenzplattform eingesetzt werden. Die resultierenden Daten sind nützlich für einen hochdurchsatzreichen, quantitativen Vergleich von integrierten DNA-Targets.

Bidirektionale Retrovirale Integrationsstelle PCR Methodik und quantitative Datenanalyse Workflow

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur genomweiten Kartierung der Integrationsorte von Moloney murinen Leukämie-Virus-basierten retroviralen Vektoren in menschlichen Zellen.

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites zur Definition zellspezifischer Regulierungsregionen

Wir beschreiben die Produktionsstrategie der Integrase-defizienten Lentivirale Vektoren (IDLVs) als Vehikel für Zellen CRISPR/Cas9 bereitzustellen. Mit der Fähigkeit, schnell und robust Gene in Zellen bearbeiten zu vermitteln IDLVs präsentieren ein sicherer und ebenso wirksame Vektor Plattform für gen-Lieferung im Vergleich zu Integrase-kompetente Vektoren.

Ein Protokoll für die Produktion der Integrase-defizienten Lentivirale Vektoren für CRISPR/Cas9-vermittelte Gen Knockout in teilenden Zellen

Wir präsentieren einen Genom engineering Workflow für die Generation der neuen in-vitro-Modelle für HIV-1-Infektion, die proviralen Integration an ausgewählten genomischen Standorten zu rekapitulieren. Ausrichtung der HIV-abgeleitete Reporter wird durch CRISPR-Cas9-vermittelten, ortsspezifische Genom Manipulation erleichtert. Detaillierte Protokolle für einzellige Klon-Generierung, Screening und richtige targeting Überprüfung stehen zur Verfügung.

CRISPR-Cas9-basierte Genom Engineering Jurkat Reporter Modelle für HIV-1-Infektion mit ausgewählten proviralen Integration Websites generieren

Genetisch kodierte Histon-miniSOG induziert genomweite vererbbare Mutationen in einem blauen Licht abhängig. Diese Mutagenese-Methode ist einfach, schnell, frei von giftigen Chemikalien und gut geeignet für vorwärts genetisches Screening und Transgen-Integration.

Optogenetische Zufallsmutagenese Mit Histon-miniSOG in<em&gt; C. elegans</em

Eine Strategie zur Erzeugung von Mutationen in Histon-Genen an ihrer endogenen Stelle in Saccharomyces cerevisiae wird vorgestellt.

Gezielt<em&gt; In Situ</em&gt; Mutagenese von Histon-Gene in Bäckerhefe

Methoden zur Generierung von groß angelegten gRNA Bibliotheken sollte einfach, effizient und kostengünstig sein. Wir beschreiben ein Protokoll für die Herstellung von gRNA Bibliotheken basierend auf enzymatische Verdauung von Ziel DNA. Diese Methode CORALINA (umfassende gRNA Bibliothek Generation durch kontrollierte Nuklease Aktivität) stellt eine Alternative zu teuren benutzerdefinierte Oligonukleotid-Synthese.

Ein universelles Protokoll für groß angelegte gRNA Bibliothek Produktion aus jeder DNA-Quelle

Die gruppierten regelmäßig dazwischen kurze palindromische Wiederholungen/CRISPR verbundenen Protein 9 (CRISPR/Cas9) System bietet ein viel versprechendes Instrument für Gentechnik und eröffnet die Möglichkeit, gezielte Integration der transgene. Wir beschreiben eine Homologie-vermittelte Ende verbinden (HMEJ)-basierte Strategie für effiziente DNA Integration in Vivo gezielte und gezielte Gentherapien verwenden CRISPR/Cas9.

CRISPR/Cas9-vermittelten gezielte Integration In Vivo mit einer Homologie-vermittelte Ende verbinden-basierte Strategie

Dieser Artikel beschreibt eine detaillierte Methode für zufällige Mutagenese Zielgen in Spalthefe. Als Beispiel Ziel ist es, rpt4 +, die kodiert eine Untereinheit der 19 s Proteasom und Bildschirm für Mutationen, die Heterochromatin destabilisieren.

Gen gezielt Random Mutagenesis Heterochromatin destabilisieren Proteasom Mutanten in Spalthefe auswählen

Lernen Sie die InSET-Methode zur Identifizierung funktioneller Lentivirus-Integrationsstellen in Zellbibliotheken. Dieses Verfahren ermöglicht die Entdeckung neuer genomischer Elemente in bisher unerforschten Regionen des menschlichen Genoms.

Identifizierung funktionell relevanter Lentivirus-Integrationsstellen in einer Insertionsmutagenese-Zellbibliothek

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