Name: Effiziente Methode zur Bildgebung der Lunge von Mäusen, die die räumliche Dynamik von Pilzsporen in den Atemwegen bewahrt (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-13T14:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Erfahren Sie eine effiziente Methode zur Bildgebung der Mäuselunge, die die räumliche Dynamik von Pilzsporen in den Atemwegen bewahrt. Dieses Protokoll ermöglicht präzise Analysen von Infektionsmechanismen.

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Alle in diesem Protokoll beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) von Rutgers Biomedical Health Sciences genehmigt.
1. Markieren Sie Sporen mit intrazellulärer Fluoreszenz
<ol>
	<li>1 x 106 Sporen in Carboxyfluorescein-Succinimidylester (CFSE), Cell Tracker Orange oder Cell Tracker Rot (oder einem intrazellulären Farbstoff Ihrer Wahl) bei 5 μM für 30 min bei 30 °C färben, dann mit PBS waschen und die Sporen bei 12.000 x g schleudern . Wiederholen Sie diese Wäsche einmal.</li>
	<li>Bereiten Sie das Sporeninokulum in der richtigen Konzentration vor, so dass 25 μl die richtige Sporendosis für eine Maus enthalten.</li>
</ol>
2. Inokulation der Maus mit Sporen durch Aspirationsinhalation mit Isofluran-Anästhesie
ACHTUNG: Isofluran ist ein flüchtiges Anästhetikum und muss in einer Elektro-Biosicherheitswerkbank oder einem Abzug verwendet werden.
<ol>
	<li>Um das Isofluran-Expositionsglas vorzubereiten, legen Sie eine gefaltete Serviette in ein 1-Liter-Nalgene-Glas mit Schraubverschluss und legen Sie einen Kunststoffnetzkreis als Plattform für die Mäuse über die Serviette. Geben Sie 2 ml Isofluran in die Serviette, schließen Sie das Glas und warten Sie 1-2 Minuten, bis sich das Gas im Behälter ausgeglichen hat.</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67556/67556fig01.jpg"> 
Abbildung 1: Vorrichtung für die offene Isofluran-Drop-Methode zur Sporeninokulation. Eine gefaltete Serviette wird in den Boden eines 1-Liter-Schraubglases gelegt, und dann wird ein kreisförmiges Plastiknetz eingesetzt, das als Plattform für die Mäuse dient. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67556/67556fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<ol start="2">
	<li>Bevor Sie die Maus einer Anästhesie aussetzen, bereiten Sie eine Pipette mit 25 μl des Inokulums vor. Platzieren Sie die Maus in den Isofluran-Behälter und kippen Sie den Behälter, um den Verlust des Aufrichtreflexes zu überwachen, wenn die Maus das Bewusstsein verloren hat und auf dem Kopf steht. Dies dauert in der Regel ca. 10 s.</li>
	<li>Überwachen Sie die Atemfrequenz (RR), bis sie sich auf konstante 50-80 Atemzüge pro Minute (bpm) verlangsamt, etwa 50% der Ruhe-RR. Dies dauert in der Regel weitere 10 s. Nehmen Sie zu diesem Zeitpunkt die Maus aus dem Isofluran-Glas. HINWEIS: Hierbei handelt es sich um eine hohe Konzentration von Isofluran, die eine schnelle Einleitung der Anästhesie bewirkt, und die Maus muss sehr genau überwacht werden. Eine tödliche Überdosierung von Isofluran ist ein Risiko, da die Konzentration von Isofluran variabel sein kann und die Dosis-Wirkungs-Kurve zu Isofluran sehr steil ist. Wenn die Atemfrequenz unter 50 Schläge pro Minute sinkt und/oder unregelmäßig ist, entfernen Sie die Maus von Isofluran, lassen Sie sie 3-5 Minuten lang einwirken und versuchen Sie es erneut (maximal zwei wiederholte Versuche).</li>
	<li>Bestätigen Sie die Narkosetiefe, indem Sie nicht auf das Einklemmen der Zehen reagieren. Positionieren Sie dann die Maus in Rückenlage in einer Hand und lassen Sie die Maus 3-5 regelmäßige Atemzüge mit zunehmender Frequenz (beginnend bei 50-60 Schlägen pro Minute) und Kraft nehmen. Zu Beginn dieser Operation platzieren Sie die Pipettenspitze am hinteren Rand des Oropharynx der Maus und geben Sie das Inokulum während einer Inhalation frei. HINWEIS: Diese Keuchen durch den Mund erschüttern den Kopf aufgrund der Rekrutierung von akzessorischen Muskeln für die Atmung nach unten. Wenn die Pipette während dieser Atemzüge eingeführt wird, sollte sich der Mund bei jedem Atemzug öffnen. Wenn sich der Mund nicht öffnet, ist die Maus unzureichend betäubt und wird wahrscheinlich keinen Inhalt aus dem Oropharynx einatmen. Die Pipette sollte die Zunge niederdrücken und sie nach unten und vorne in den Mund drücken, um ein Verschlucken des Inokulums zu verhindern. Wenn sich die Pipette im Mund befindet und die Maus ausreichend betäubt ist, öffnet die Maus mit jedem Atemzug ihren Mund.</li>
	<li>Fühlen Sie mit der Hand und dem Daumen, die die Maus halten, nach Knistern an den hinteren und vorderen Aspekten des Brustkorbs der Maus, um die Inhalation des Inokulums zu bestätigen.</li>
</ol>
3. Euthanasie von Mäusen
<ol>
	<li>Injizieren Sie der Maus intraperitoneal einen Cocktail aus 200 mg/kg Ketamin und 24 mg/kg Xylazin 10 Minuten vor dem Opferzeitpunkt.</li>
	<li>Warten Sie 10 Minuten nach der Injektion, bis die Maus in eine chirurgische Anästhesieebene eintritt, was durch ein mangelndes Ansprechen auf das Einklemmen der Zehen bestätigt wird.</li>
</ol>
4. Durchblutung der Lunge mit PBS und Formalin
<ol>
	<li>Besprühen Sie die betäubte Maus mit 70% Ethanol. Schneide mit einer Schere die Haut der Maus zurück und ziehe die Haut auseinander, um das Bauchfell von allen Seiten freizulegen. Ziehen Sie die Haut von der oberen Hälfte der Maus über den Kopf und ziehen Sie die Arme aus der Haut heraus.</li>
	<li>Schneiden Sie die Peritonealmembran am Brustbein und entlang der unteren Seite des Brustkorbs und legen Sie das Peritoneum frei. Verschieben Sie die Leber nach unten und legen Sie das Zwerchfell frei. Verwende eine Schere, um das Zwerchfell vorsichtig vom Lungenparenchym weg zu punktieren, um ein Loch in der Lunge selbst zu vermeiden. HINWEIS: Ein versehentliches Durchstechen der Lunge macht ein anschließendes Aufblasen der Luft unmöglich.</li>
	<li>Nachdem das Zwerchfell durchstochen wurde, tritt Luft in den Thorax ein und kollabiert die Lunge. Schneide den Brustkorb auf der linken Seite auf, um das Herz freizulegen. Injizieren Sie 5-10 ml PBS mit einer 30-g-Nadel in den rechten Ventrikel mit einer Rate von 1 ml pro 5 s (um eine Beschädigung der Gefäße zu vermeiden) und hellen Sie die Lunge schnell auf. VORSICHT: Formalin ist eine gefährliche flüchtige Substanz, die in einer Biosicherheitswerkbank oder einem Abzug gehandhabt werden sollte.</li>
	<li>Wenn Sie fertig sind, entfernen Sie die Nadel und injizieren Sie mit einer neuen Nadel 5 ml 10% neutralgepuffertes Formalin (NBF) mit der gleichen Geschwindigkeit in den rechten Ventrikel.</li>
</ol>
5. Aufblasen der perfundierten Lunge
<ol>
	<li>Entferne die vordere Hälfte des Brustkorbs. Um die Luftröhre freizulegen, schneiden Sie die oberen Rippen und Schlüsselbeine rechts und links des Halses ab. Achten Sie darauf, dass Sie nicht in der Nähe der Mittellinie schneiden, wo die Luftröhre liegt. Fassen Sie mit einer Pinzette die verbleibenden oberen Rippen und Schlüsselbeine an der Mittellinie des Halses an und ziehen Sie überlegen, bis die Luftröhre freiliegt.</li>
	<li>Bereiten Sie einen Nahtanden von 10 cm Länge vor, ziehen Sie ihn unter die Luftröhre und binden Sie einen losen Knoten am unteren Ende der freiliegenden Luftröhre. Bereiten Sie eine 1-ml-Spritze mit Luft und einem 18-G-Katheter vor. Verwende eine 18 G Nadel, um ein Loch in die Luftröhre am oberen Ende des freiliegenden Bereichs zu bohren.</li>
	<li>Platzieren Sie den Katheter in diesem Loch und achten Sie auf einen relativ festen Sitz, um zu verhindern, dass Luft entweicht. Injizieren Sie die 1 ml Luft langsam über einen Zeitraum von 10 s in die Lunge und achten Sie dabei auf das Aufblasen aller Lungenlappen. Das vollständige Aufblasen führt dazu, dass sich die Lungen leicht um das Herz wickeln und das Volumen füllen, das sie im unpunktierten Zwerchfell einnehmen.</li>
	<li>Ziehe den Knoten fest um die Luftröhre und entferne den Katheter. Halten Sie die Luftröhre fest und verwenden Sie eine stumpfe Schere, um die Lunge von der Maus zu entfernen, und achten Sie darauf, die Lunge nicht zu punktieren.</li>
</ol>
6. Immersionsfixierung und Dehydrierung
<ol>
	<li>Legen Sie die Lunge auf den oberen Rand eines konischen 50-ml-Röhrchens, das mit 20 mL 10 % NBF gefüllt ist. Halten Sie die Nahtfäden außerhalb des Konischen, schrauben Sie die Kappe fest und drehen Sie den Konus um, so dass die Lunge kopfüber in 20 ml NBF aufgehängt wird. Stellen Sie es 24-48 h lang bei 4 °C auf.</li>
	<li>Spülen Sie die Lunge mit PBS und legen Sie sie dann für 72-96 h bei 4 °C in eine 30%ige Saccharose-PBS-Lösung, um die Lunge zur Vorbereitung der Kryokonservierung zu dehydrieren. Entfernen Sie die Lunge von der Saccharose, legen Sie die Lunge in ein Kryomold mit optimaler Schneidtemperatur (OCT) und frieren Sie die Probe bei -80 °C ein.</li>
</ol>
7. Kryosektion
<ol>
	<li>Äquilibrieren Sie die Proben in OCT-Kryoblöcken 1 h lang auf die -20 °C Temperatur des Kryostaten, bevor Sie schneiden. Die Blöcke bei einer Dicke von 20-100 μm schneiden. HINWEIS: Das Aufblasen von Luft kann zu einer erhöhten Zerbrechlichkeit der Probe führen, und das Schneiden mit erhöhter Dicke kann einen Gewebebruch während des Schnitts verhindern.</li>
	<li>Sammeln Sie die Schnitte auf Objektträgern und lassen Sie sie 30 Minuten bis 1 Stunde trocknen, um sicherzustellen, dass das Gewebe am Objektträger haftet. HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt können die Objektträger bei -80 °C gehalten werden.</li>
</ol>
8. Vorbereitung und Blockieren von Objektträgern
<ol>
	<li>Legen Sie die Objektträger 30 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) in ein PBS-Bad (in eine Schüssel oder ein Coplin-Glas), um die OCT von den Objektträgern zu entfernen. HINWEIS: Dickere Abschnitte (40-100 μm) haften möglicherweise nicht so gut an Objektträgern wie dünnere Abschnitte, daher ist es am besten, sie flach und aufrecht in einer Schale aufzubewahren, anstatt sie auf der Seite in ein Coplin-Glas zu legen.</li>
	<li>Trocknen Sie die Objektträger, nachdem sich OCT vom Gewebe gelöst hat. Verwenden Sie ein Tuch, um überschüssige Tröpfchen vom Umfang des Objektträgers um die Gewebeprobe herum zu trocknen. </li>
	<li>Zeichnen Sie mit einem hydrophoben Pap-Stift einen Umfang um die Probe und lassen Sie sie 5 Minuten trocknen.</li>
	<li>Bereiten Sie einen Blockierungspuffer aus tierversuchsfreier Blockierungslösung mit 0,3 % Tween-20 und 1:100 Fc Block in 300 mL pro Objektträger vor. HINWEIS: Für intrazelluläre Ziele kann 1 % Tween-20 verwendet werden. Ein Volumen von 300 μl ist in der Regel ausreichend, aber das notwendige Volumen, um das Gewebe vollständig abzudecken, hängt von der Perimetergröße des hydrophoben Markers ab. Ab diesem Zeitpunkt sollte das Gewebe nicht mehr trocknen.</li>
	<li>Lassen Sie die Blocklösung 1 h bei RT auf den Objektträgern.</li>
</ol>
9. Immunfärbung
<ol>
	<li>Waschen Sie den Objektträger, indem Sie die Flüssigkeit abpipettieren und 300-500 μl PBS hinzufügen. Wiederholen Sie den Waschgang einmal.</li>
	<li>Bereiten Sie den primären AlexaFluor-647-konjugierten Anti-Maus-EpCAM-Antikörper (Klon G8.8) für Ratten (Epithelmarker der Atemwege) in tierversuchsfreier Blockerlösung mit 0,33 % Tween-20 (oder 1 % für intrazelluläre Ziele) vor. Fügen Sie 300 μl dieser Lösung pro Objektträger hinzu und färben Sie sie über Nacht bei 4 °C. HINWEIS: Antikörper sollten empirisch auf Färbekonzentration, Zeit und Temperatur getestet werden. Dünnschliffe (8-20 μm) werden für 30 min bei 37 °C und dickere Schnitte (20-100 μm) bei 4 °C über Nacht mit Verdünnungen von 1:100 für die meisten Antikörper gefärbt. Bei Verwendung von unkonjugierten Antikörpern waschen Sie sich 2x (wie oben) und legen Sie einen sekundären fluoreszierenden Antikörper für eine empirisch bestimmte Zeit und Temperatur auf. Im Allgemeinen wird die Sekundärantikörperfärbung bei RT für 1 h bei einer Verdünnung von 1:1000 durchgeführt.</li>
	<li>Entfernen Sie die Antikörperlösung aus der Probe und waschen Sie den Objektträger 5 Minuten lang mit 300 mL PBS. Wiederholen Sie diese Wäsche einmal. Trocknen Sie die Objektträger und entfernen Sie alle überschüssige Flüssigkeit aus der Probe und dem umgebenden Glas.</li>
	<li>Geben Sie einen Tropfen RT Softset-Eindeckmedium (z. B. SlowFade Glas) auf jedes Gewebestück. Achten Sie darauf, Blasen zu vermeiden, indem Sie die Flasche auf dem Kopf stehen lassen und jeden Tropfen langsam auf das Taschentuch tropfen lassen. Legen Sie ein Deckglas in geeigneter Größe an, das über den Umfang der Probe und des hydrophoben Markers hinausragt.</li>
</ol>
10. Bildgebung mittels Fluoreszenzmikroskopie
<ol>
	<li>Verwenden Sie ein Mehrkanal-Fluoreszenzmikroskop, um ganze Lungenabschnitte unvoreingenommen zu scannen, indem Sie ein Objektiv mit ausreichender Auflösung verwenden, um einzelne Sporen und Wirtszellen aufzulösen (z. B. Zeiss Axioscan 7 mit 20x Ölobjektiv mit NA = 0,8 oder ähnlichem). HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Laserleistung und die PMT-Spannungsverstärkung so eingestellt sind, dass die Signal-Rausch-Verhältnisse des Ziels über dem Hintergrund maximiert werden, die mit einem FMO-Regler (Fluoreszenz minus eins) bestimmt werden.</li>
	<li>Sammeln Sie ausreichend Bildkacheln, um den gesamten Lungenlappen zu erfassen (z. B. ~200 Kacheln mit einer Größe von 400 μm x 400 μm). Verwenden Sie die Mikroskop-Software (z. B. Zeiss ZEN 3.7 oder ähnlich), um das zusammengeführte Kachelbild für die Weiterverarbeitung zu exportieren.</li>
</ol>
11. Räumliche Analyse über QuPath
<ol>
	<li>Erstellen Sie in QuPath, einer kostenlosen Open-Source-Software14, eine Projektdatei und fügen Sie die Fluoreszenzbilder zur Datei hinzu.</li>
	<li>Klassifizieren Sie die EpCAM+-Pixel als Epithel, indem Sie auf die obere Menüoption Klassifizieren und dann auf Pixelklassifizierung &gt; Schwellenwert erstellen klicken. Wählen Sie die Auflösung, den Kanal, das Glättungs-Sigma und den Schwellenwert aus, der den Zielbereich am besten identifiziert. Speichern Sie den Klassifikator unter einem eindeutigen Namen, und wählen Sie Objekte erstellen aus.</li>
	<li>Wählen Sie im neuen Fenster Objekte erstellen die Option Neuer Objekttyp als Anmerkung aus. Legen Sie für das Lungenepithel die minimale Objektgröße und die minimale Lochgröße auf 100 mm2 fest. Hier ist es nicht erforderlich, Objekte teilen auszuwählen. Nachdem Sie OK ausgewählt haben, werden die Anmerkungen erstellt und können mit dem Pinsel im oberen linken Bereich mit dem Auge geändert werden.</li>
	<li>Um Sporen zu klassifizieren, wiederholen Sie die Schritte von 11.3 bis 11.4 mit dem Kanal, in dem die Sporen gefangen wurden, und legen Sie den neuen Objekttyp Erkennung anstelle von Anmerkung fest. Legen Sie die minimale Objektgröße und die minimale Bohrungsgröße auf 0 mm2 fest, und wählen Sie Objekte teilen aus.</li>
	<li>Um eine räumliche Analyse der Sporen durchzuführen, wählen Sie im oberen Menü die Option Analysieren &gt; Räumliche Analyse &gt; Berechnen der vorzeichenbehafteten Entfernung zu den Anmerkungen 2D. Die Entfernungen zum EpCAM+-Epithel werden für jede detektierte Spore berechnet. Exportieren Sie diese über den oberen Menüpunkt Messen &gt; Messungen exportieren.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Konservierung der Pilzsporenlokalisierung in der Lunge für die Fluoreszenzmikroskopie

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<li>Bodnar, M. J., Ratuski, A. S., Weary, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+isoflurane+anesthesia+using+the+drop+method%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Mouse isoflurane anesthesia using the drop method.</a> Lab Anim. 57 (6), 623-630 (2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>18 G, 1 1/2 Nadel (305185)</td><td>Fisher</td><td>305185</td><td></td></tr><tr><td>1 L&nbsp; Schraubglas &nbsp; (Nalgene)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-823-33</td><td></td></tr><tr><td>Air-Tite Bulk Unsterile Spritzen 10 mL Luer</td><td>Lock Fisher</td><td>14-817-175</td><td></td></tr><tr><td>AnaSed Injektion (sterile Xylazinlösung)</td><td>Akorn</td><td>59399-110-20</td><td></td></tr><tr><td>Tierfreier Blocker und Verdünner, RTU</td><td>Vector</td><td>SP-5035-100</td><td></td></tr><tr><td>BD Insyte Autoguard Winged Shielded IV Katheter mit BD Vialon Katheter Material 18 G x 1,88 Zoll</td><td>BD</td><td>381547</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharmingen gereinigte Ratte Anti-Maus CD16/CD32 (Maus BD Fc Block&Trade;)</td><td>BD</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Orange CMRA Farbstoff</td><td>Fisher</td><td>Scientific NC0873640</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Labviva</td><td>75003</td><td></td></tr><tr><td>Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3&Delta; &nbsp;</td><td>BEI Resources</td><td>NR-166</td><td></td></tr><tr><td>Corning 70 Mikron Siebe</td><td>VWR</td><td>10054-456</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM AlexaFluor647 monoklonaler Antikörper</td><td>Biolegend</td><td>118211</td><td></td></tr><tr><td>Exel International HYpodermic Needles 30 G x 1/2"</td> <td>Labviva</td><td>EN3012</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Sterile Spritzen zum Einmalgebrauch (1 ml, Leur Slip)</td><td>Fisher</td><td>14-955-462</td><td></td></tr><tr><td>Glukose-Monohydrat</td><td>Azer Scientific&nbsp;</td><td>ES17530-500G</td><td></td></tr><tr><td>Hochvakuumfett</td><td>VWR</td><td>59344-055</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 Lösung 20 mM (5 mL)</td><td>ThermoFischer</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran USP</td><td>Covetrus</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>Ketaminhydrochlorid</td><td>Dechra</td><td>1000001250</td><td></td></tr><tr><td>KIMWIPES Delicate Task Wischer (4,4'' x 8,4")</td><td>VWR</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>Lexer Babyschere</td><td>FST</td><td>14078-10</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Adson-Pinzette</td><td>FST</td><td>11018-12</td><td></td></tr><tr><td>Neutral gepuffertes Formalin (10%) (Azer Scientific)</td><td>Fisher</td><td>22-026-350</td><td></td></tr><tr><td>Nunc EasYFlask Gewebekulturflaschen, T75, Filterkappen</td><td>VWR</td><td>15708-134</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>VWR</td><td>45000-446</td><td></td></tr><tr><td>Peel-A-Way Einbettformen</td><td>Sigma</td><td>E6032-1CS</td><td></td></tr><tr><td>QuPath 0.5.1 Software</td><td>Open-Source</td><td>https://qupath.github.io/</td><td></td></tr> <tr><td>Silk Nahtgarn Stärke 3/0</td><td>FST</td><td>18020-30</td><td></td></tr><tr><td>ObjektträgerMicro Slides Superfrost Plus&nbsp;</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>SlowFade Glas Soft-Set Antifaden Eindeckmittel (2 mL)</td><td>ThermoFischer</td><td>S36917</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td></td><td>Sigma S0389-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Compound, Sakura Finetek</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>ThermoFischer</td><td>J20605. </td><td></td>AP</tr><tr><td>Vector Laboratories ImmEDGE Hydrophober Barrierestift 2er-Set</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9545623</td><td></td></tr><tr><td>VWR Micro Cover Brille, rechteckig (24 mm x 40 mm #1.5)</td><td>VWR</td><td>48393-230</td><td></td></tr><tr><td>Weißes Kunststoff-Drahtgeflecht</td><td>MAPORCH</td><td>789862904922</td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Fisher</td><td>BP9727-500</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss AxioScan 7&nbsp;</td><td>Carl Zeiss Microscopy GmbH</td><td>https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/imaging-systems/axioscan-for-biology.html</td><td>Mehrkanal-Fluoreszenzmikroskop</td></tr><tr><td>ZEN 3.7 Software</td><td>Carl Zeiss Microscopy GmbH</td><td>https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/software/zeiss-zen.html</td><td>Mikroskopie-Software</td></tr></tbody></table>

effiziente methode zur bildgebung der lunge von mäusen, die die räumliche dynamik von pilzsporen in den atemwegen bewahrt

Efficient Method for Imaging Murine Lungs that Preserves Spatial Dynamics of Fungal Spores in the Airways

Diese Methode erzeugt schließlich Immunfluoreszenzbilder von Mauslungen unter Verwendung physiologischer Luftblase, um die Atemwege ungestört zu lassen. Wichtig ist, dass mehrere Prüfpunkte auf dem Weg bestätigen, dass Komponenten des Protokolls erfolgreich ausgeführt wurden. Während der Inokulation ist es wichtig zu bestätigen, dass das Inokulum aspiriert wurde, indem man nach "Knistern" an der hinteren Brustwand der Maus tastet, die darauf hinweisen, dass die Flüssigkeit in die Atemwege gelangt ist. Wenn kein Knistern zu spüren ist, ist es möglich, dass die Maus das Inokulum verschluckt hat. Die Perfusion der Lungen von Mäusen mit PBS sollte zu einer weißen Fleckigkeit der Lunge führen, gefolgt von einer vollständigen Aufhellung der gesamten Lunge (Abbildung 2A). Kommt es zu einer unvollständigen Aufhellung, erreicht die anschließende Formalinperfusion nicht alle Bereiche des Lungenparenchyms (Abbildung 2B). Wenn Sie die Lunge mit Luft aufblasen, sollten sich die Lungen langsam ausdehnen, bis sie die physiologische Größe erreicht haben. Nach dem Binden der Trachealnaht, um die Luft in der Lunge zu sichern, sollte sich die Lunge nicht in der Größe zusammenziehen. Wenn dies der Fall ist, wurde die Lunge wahrscheinlich während des Eingriffs punktiert.
Hier zeigen wir repräsentative Bilder von Schnitten mit markierten Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ Sporen (grün) und EpCAM+ säulenförmigem bronchiolärem Epithel (magenta) sowohl in luft- als auch in formalinflüssigkeitsaufgeblähten Lungen (Abbildung 3A,B). Diese Sporen akkumulieren sich hauptsächlich in den distalen Bronchiolen und in den Alveolarräumen unmittelbar neben diesen distalen Bronchiolen, wahrscheinlich in den Alveolargängen. Die luftaufgeblasene Lunge mit Fixiermittel enthält Sporen, die häufiger in den Bronchiolen vorkommen und sich näher an den Bronchiolen ansammeln (Abbildung 3A), als das flüssige Fixiermittel, wo die Sporen etwas stärker vom Bronchiolarepithel verteilt erscheinen (Abbildung 3B). Durch die räumliche Analyse von QuPath messen wir den Abstand einzelner Sporen zum nächstgelegenen EpCAM+-Bronchiolarepithel, um den Grad der Ausbreitung der Sporen weg von den Bronchiolen in weiter entfernte Alveolarräume anzuzeigen. Wir zeigen, dass die Flüssigkeitsinflation die Sporen weiter von den Bronchiolen entfernt verteilt, verglichen mit der physiologischen Luftinflation (Abbildung 4A,B). Die luftaufblasende Gefäßperfusion bewahrt die natürliche Positionierung dieser Sporen in den distalen Bronchiolen und verhindert die künstliche Ausbreitung dieser Sporen in distalere Alveolarräume durch intratracheale fixierende Instillation.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67556/67556fig02.jpg"> 
Abbildung 2: Indikation des Erfolgs der Lungenperfusion. (A) Die erfolgreich perfundierte Lunge ist vollständig weiß. (B) Unvollständig durchblutete Lungen erscheinen rosa oder gesprenkelt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67556/67556fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67556/67556fig03.jpg"> 
Abbildung 3: Repräsentative Bilder der Sporenverteilung in luftaufgeblasenen Formalin-perfundierten Lungen im Vergleich zu formalin-aufgeblähten Lungen. Intrazelluläre fluoreszierende Sporen (grün) sind in (A) luftaufgeblähten Lungen in größerer Nähe des EpCAM+ bronchiolären Epithels (magenta) verteilt als in (B) formalin-aufgeblähten Lungen. Die Bilder wurden von Schnitten mit einer Tiefe von 1,2 mm von der hinteren Oberfläche der linken Lappen der Mäuse in jeder Behandlungsgruppe an einem Mehrkanal-Fluoreszenzmikroskop bei 20-facher Vergrößerung aufgenommen, und die Kacheln wurden mit Hilfe einer Mikroskopiesoftware zusammengefügt. Maßstabsleiste = 800 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67556/67556fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67556/67556fig04.jpg"> 
Abbildung 4: Vergleich des Sporenabstands (mm) zum Bronchiolarepithel zwischen luft- und formalinaufgeblähten sporenbehandelten Lungen. Lungen von 3 Mäusen pro Behandlungsgruppe wurden entnommen, verarbeitet und 1,5 h lang nach der Inokulation mit 1 x 106 Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ Arthrokonidien abgebildet. Vier Schnitte pro Maus wurden in einem Abstand von 0,8 mm, 1,2 mm, 1,6 mm und 2,0 mm von der hinteren Oberfläche des linken Lappens entnommen, gefärbt und an einem Mehrkanal-Fluoreszenzmikroskop abgebildet. Alle Sporen aus jeder Gruppe wurden in QuPath nachgewiesen und räumlich analysiert, um den (A) Abstand zum nächsten säulenförmigen EpCAM+-Bronchiolarepithel zu bestimmen, und (B) die Median- und 95%-Konfidenzintervalle werden in Einheiten von Mikrometern angezeigt. Sporen, die in der Luft aufgeblasen werden, n = 11.673. Sporen beim Aufblasen von Flüssigkeiten, n = 9.837. Der Mann-Whitney-t-Test wurde aufgrund mangelnder Normalität durchgeführt und p &lt; 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67556/67556fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Effiziente Methode zur Bildgebung der Lunge von Mäusen, die die räumliche Dynamik von Pilzsporen in den Atemwegen bewahrt

Fungi infect humans when environmental spores are inhaled into the lungs. The lung is a heterogeneous organ. Conducting airways, including bronchi and ...

efficient-method-for-imaging-murine-lungs-that-preserves-spatial

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Wir zeigen, wie 2-Photonen-Mikroskopie für die Beobachtung der Dynamik der neutrophilen Granulozyten im infizierten Lungengewebe verwenden, während sie Krankheitserreger oder phagozytieren produzieren neutrophilen extrazellulären Traps (NETs).

Direkte Beobachtung der Phagozytose und NET-Bildung durch Neutrophile im infizierten Lungengewebe mittels 2-Photonen-Mikroskopie

Dieses Video beschreibt eine Methode zur Vorbereitung von Lungen für die ex vivo Live-Bildgebung, um Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und Stromazellen zu untersuchen, wobei Agarose zum Aufblasen verwendet wird. Im Probenprotokoll wird das Agarose-Aufblasverfahren beschrieben, bevor lebende zelluläre Wechselwirkungen beobachtet werden.

Agarose-Inflation der ganzen Lunge: Eine Methode zur Vorbereitung der Lunge für die ex vivo Live-Bildgebung

Wir beschreiben ein relativ einfaches Verfahren zur ex vivo Echtzeit-Bildgebung der Tumorzell Stroma Wechselwirkungen innerhalb Lungenmetastasen unter Verwendung fluoreszierenden Reportern in Mäusen. Verwendung von Spinnplatten konfokale Mikroskopie, ermöglicht diese Technik Visualisierung von lebenden Zellen für mindestens 4 h und angepasst werden könnten andere entzündliche Lungenerkrankungen zu untersuchen.

Ex-vivo-Live-Imaging von Lungenmetastasen und deren Mikromilieu

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung der Multiphotonenmikroskopie zur Durchführung einer langfristigen hochauflösenden Einzelzellbildgebung der intakten Lunge in Echtzeit unter Verwendung eines vakuumstabilisierten Bildgebungsfensters.

Langfristige High-Resolution Intravitalmikroskopie in der Lunge mit einem Vakuum-Stabilisierte Imaging-Fenster

Wir beschreiben eine nichtinvasive multimodale Bildgebung Ansatz basierend auf Mikro-CT und Fluoreszenz Molekulare Computertomographie für längs-Beurteilung der Lunge Fibrose Mausmodell durch doppelte intratracheale Instillation von Bleomycin induziert.

Eine multimodale Bildgebung Ansatz basierend auf Mikro-CT und Fluoreszenz Molekulare Computertomographie für längs-Bewertung der Bleomycin-induzierten Lungenfibrose bei Mäusen

Wir beschreiben die optische Bildgebung von Mäusen mit Mycobacterium Tuberculosis (Mycobacterium Tuberculosis) mit Reporter Enzym Fluoreszenz (REF) infiziert. Dieses Protokoll ermöglicht den sensitiver und spezifischen Nachweis von Mycobacterium Tuberculosis in präklinischen Tiermodellen für die Pathogenese, Therapie und Impfstoff-Forschung.

Mycobacterium Tuberculosis in Mäusen mit Reporter Enzym Fluoreszenz Imaging

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur pulmonalen Pilz Belastung bei Mäusen mit invasiver Aspergillose durch Quantifizierung der Gomoris modifizierten Methanamine Silber Färbung in histologischen Abschnitte bestimmen. Verwendung dieser Methode führte zu vergleichbaren Ergebnissen mit weniger Tiere im Vergleich zu Bewertung der Pilzinfektionen Belastung durch quantitative PCR der Lunge Pilz DNA.

Histologischen Quantifizierung Lunge Pilz Belastung in experimentellen Aspergillose bestimmen

In dieser Studie stellen wir ein Protokoll zur zwei-Photon intravitalen Bildgebung und Zelle Interaktionsanalyse in der murinen trachealen Schleimhaut nach Infektion mit Influenza-Virus führen. Dieses Protokoll wird für Forscher Immunzelle Dynamik bei Atemwegsinfektionen relevant sein.

Bildgebung Zelle Interaktion in Trachealen Schleimhaut während der Influenza-Virus-Infektion mit Intravitalen zwei-Photonen-Mikroskopie

In dieser Publikation beschreiben wir Protokolle zur Beurteilung der Atemwegs-Mukociliären Clearance (MCC) bei Mäusen in vivo unter Verwendung von Dual-Modality-Radionuklid-Bildgebung. Dieses Protokoll ist für eine einzelne Photonenemissions-Computertomographie (SPECT) und Einerfassungsprotokoll für Computertomographie (CT) mit Maus-Ganzkörper-Kollimatoren (MWB) in einem dualen SPECT/CT-System konzipiert.

In vivo Bewertung der mukociliären Clearance bei Mäusen

Wir beschreiben die Methode zur quantitativen Analyse der Verteilung von Aspergillus fumigatus conidia (3 μm groß) in den Atemwegen von Mäusen. Die Methode kann auch für die Analyse von Mikropartikeln und Nanopartikelagglomeratverteilung in den Atemwegen in verschiedenen pathologischen Zustandsmodellen verwendet werden.

Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie-basierte quantitative Analyse der Aspergillus fumigatus Conidia-Verteilung in der optisch geklärten Mauslunge

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die intravitale Bildgebung einer abgeschwächten, BSL-2-zugelassenen Mycobacterium tuberculosis. Spannung in der Mauslunge unter Verwendung eines permanenten Lungenfensters. Dieser Ansatz ermöglicht eine longitudinale, einzelzellige Auflösungsanalyse früher Wirts-Pathogen-Interaktionen, einschließlich bacillärer Lokalisation, vaskulärer Dynamik und Makrophagenaufnahme innerhalb derselben Lungenmikroumgebung.

Intravitale Bildgebung der abgeschwächten auxotrophen Mycobacterium tuberculosis in der Mauslunge während früher intravaskulärer Infektion

Erfahren Sie eine effiziente Methode zur Bildgebung der Mäuselunge, die die räumliche Dynamik von Pilzsporen in den Atemwegen bewahrt. Dieses Protokoll ermöglicht präzise Analysen von Infektionsmechanismen.

Effiziente Methode zur Bildgebung der Lunge von Mäusen, die die räumliche Dynamik von Pilzsporen in den Atemwegen bewahrt

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