Isolierung und dendritische Zellaufnahme von kleinen extrazellulären Vesikeln aus Echinococcus granulosus

Unsere Forschung konzentriert sich auf die Charakterisierung der extrazellulären Vesikel von Echinococcus granulosus und deren Rolle bei Parasit-Wirt-Interaktionen. Wir untersuchen die Aufnahme der Zusammensetzung durch dendritische Zellen des Wirts und den möglichen Einfluss auf die Immunmodulation. Wir konnten zeigen, dass E. granulosus EV von dendritischen Zellen aufgenommen werden, was die Reifung und Antigenpräsentation beeinflusst. Wir identifizieren auch wichtige immunmodulatorische und antigene Proteine in der EV-Fracht, die Parasit-Wirt-Interaktionen und Immunantworten beeinflussen können.

Unser Protokoll optimiert die In-vitro-Parasitenkultur für eine verbesserte Produktion kleiner EVs, gewährleistet eine qualitativ hochwertige Isolierung und integriert dendritische Zellassays zur Untersuchung der Immunmodulation. Es kann als Ganzes oder in Teilen angewendet werden. Unsere zukünftige Forschung wird die in vivo-Auswirkungen von E. granulosus EVs auf Immunantworten, ihr Potenzial als Impfstoffkomponenten und ihre Auswirkungen auf dendritische Zellen, Mikrophagen und die Immunmodelle dieser Zellen untersuchen.

[Erzähler] Reinigen Sie zunächst die ventrale Oberfläche der euthanasierten Maus mit Hydatiden-Krankheit mit 70%igem Alkohol. Öffnen Sie die Bauchhöhle chirurgisch, um die entwickelten Metazestoden mit Schere und Pinzette zu entfernen. Übertragen Sie dann die Metazestodenmassen mit einer Pinzette in eine sterile Petrischale. Entfernen Sie das Bindegewebe bei Bedarf mit einer Pinzette, um die Zysten von den Metazestodenmassen zu lösen. Waschen Sie die erhaltenen Metazestoden mit supplementiertem PBS bei vier Grad Celsius. Bereiten Sie nun das Nährmedium mit allen erforderlichen Komponenten vor und mischen Sie die Lösung vorsichtig durch Inversion. Fünf Milliliter des vorbereiteten Nährmediums werden in jedes Leighton-Röhrchen überführt. Geben Sie die Parasiten in das Kulturmedium und inkubieren Sie die Röhrchen fünf Tage lang bei 37 Grad Celsius, ohne das Medium zu wechseln. Sammeln Sie das Parasitenkulturmedium aus jedem Leighton-Röhrchen und geben Sie es in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Das gesammelte Medium bei 300 g wird 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius zentrifugiert und der Überstand wird in ein neues konisches 15-Milliliter-Röhrchen überführt. Zentrifugieren Sie nun den Überstand bei 2.000 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Den entstandenen Überstand mit einer Pipette in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen überführen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 10.000 g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius, um kleinere Zelltrümmer zu entfernen. Der Überstand wird mit einer Pipette in ein für den Ultrazentrifugenrotor geeignetes Röhrchen überführt. Markieren Sie eine Seite der Tube mit einem Marker. Und setzen Sie das Rohr mit der markierten Seite nach oben in den Rotor ein. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 100.000 g eine Stunde lang bei vier Grad Celsius. Gießen Sie den Überstand schnell ab und lassen Sie das Röhrchen eine Minute lang auf dem Kopf stehen. Waschen Sie das Pellet mit mindestens drei Millilitern PBS, um die kontaminierenden Proteine zu entfernen. Suspendieren Sie das Pellet mehrmals mit einer Pipette entlang aller Röhrchenflächen und konzentrieren Sie sich dabei auf die markierte Seite, an der das Pellet erwartet wird. Nach Wiederholung der Ultrazentrifugation resuspendieren Sie das Pellet in 30 Mikrolitern PBS. Übertragen Sie die resuspendierte Probe in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen und frieren Sie die extrazellulären Vesikel zur Lagerung bei minus 80 Grad Celsius ein. Besprühen Sie die euthanasierte fünf bis acht Wochen alte weibliche CF-1-Maus mit Ethanol, bevor Sie sie in eine Gewebekulturhaube legen. Legen Sie die Maus in Rückenlage auf ein Präparierbrett. Machen Sie mit einer Pinzette und einer Präparierschere einen vertikalen T-Schnitt über der Harnröhre und verlängern Sie ihn horizontal bis zum oberen Ende der unteren Extremitäten. Trennen Sie mit einer Pinzette die Haut entlang beider Hintergliedmaßen, um die Beinknochen und das Gewebe freizulegen. Entfernen Sie mit den Händen die Haut jedes Beins, nachdem Sie vom Knöchel in Richtung Bauch gedrückt haben, ziehen Sie die Haut auf die gegenüberliegende Seite, so dass beide Beine frei von der Haut bleiben. Entfernen Sie nun vorsichtig den Oberschenkelknochen und das Schienbein mit einer Schere und einer Pinzette, um sicherzustellen, dass kein Bruch entsteht. Befestigen Sie die Spitze jedes Knochens mit einer Pinzette. Und schneiden Sie die Sehnen durch, um Muskelfaszien um die Knochen herum zu entfernen. Vollständige Reinigung des Muskelgewebes mit Papierservietten. Legen Sie jeden entnommenen Knochen in ein steriles 50-Milliliter-Röhrchen mit zwei Millilitern ergänztem RPMI-Medium, um Ablagerungen zu entfernen. Nachdem Sie das Medium entsorgt haben, waschen Sie die Knochen zweimal jeweils fünf Minuten lang mit 70 % Ethanol. Übertragen Sie die gewaschenen Knochen in eine sterile Petrischale und schneiden Sie die beiden Knochenepiphysen mit einer scharfen Präparierschere ab, um Zugang zu den Knochenmarkzellen zu erhalten. Spülen Sie mit einer 25-Gauge-Nadel, die an einer 20-Milliliter-Spritze mit vollständigem Medium befestigt ist, vorsichtig die Knochenmarkzellen von jedem der vier Knochen in eine sterile Petrischale. Homogenisieren Sie dann das Medium, das das entgangene Knochenmark enthält, vorsichtig durch Pipettieren, um Knochenbindegewebe und Zellklumpen zu entfernen. Übertragen Sie die Probe in ein steriles konisches 50-Milliliter-Röhrchen und leiten Sie die Zellen durch ein steriles 70-Mikrometer-Zellsieb aus Polypropylen, um Bindegewebe und Knochentrümmer zu entfernen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 450 g für sieben Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig und stellen Sie sicher, dass das Pellet an der Rohrwand haftet. Nachdem Sie die Zellen eine Minute lang bei Raumtemperatur inkubiert haben, resuspendieren Sie sie in 500 Mikrolitern RBC-Lysepuffer und neutralisieren Sie den Lysepuffer mit drei Millilitern vollständigem Medium. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 450 g für sieben Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in fünf Millilitern vollständigem Medium. Nachdem Sie die Probe wie gezeigt filtriert haben, zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Geben Sie 300 Nanogramm pro Milliliter rekombinanten murinen FMS-verwandten Tyrosinkinase-Drei-Liganden oder FLT3L in das Kulturmedium. Plattieren Sie die Zellen in einer Multi-Well-Platte in einer Konzentration von eins mal 10 hoch sechs Zellen pro Milliliter. Inkubieren Sie die Zellen sieben Tage lang bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid. Am dritten Tag entnehmen Sie aus jeder Vertiefung einen Milliliter Medium, ohne die Zellen zu stören, und ersetzen Sie es durch einen Milliliter vorgewärmtes frisches vollständiges Medium, ergänzt mit 150 Nanogramm pro Milliliter rekombinantem murinischem FLT3L. Die extrazellulären Vesikel (EVs), die aus dem Larvenstadium von Echinococcus granulosus gereinigt wurden, waren in erster Linie kleine EVs mit Größen von 50 bis 200 Nanometern, was durch dynamische Lichtstreuung und Transmissionselektronenmikroskopie bestätigt wurde. Dendritische Zellen aus dem Knochenmark zeigten über einen Zeitraum von sieben Tagen eine morphologische Differenzierung und entwickelten sich von kleinen, runden hämatopoetischen Zellen zu sternförmigen Zellen mit zytoplasmatischen Fortsätzen. Nach einer Stunde Inkubation fingen die dendritischen Zellen fluoreszenzmarkierte kleine EVs ein, die mit MHCIII-Molekülen in endosomal-lysosomalen Kompartimenten kolokalisiert waren, wie die konfokale Mikroskopie bestätigte.