Kochsalzspülung zur Probenahme der nasalen Immunmikroumgebung des Hundes

Wir untersuchen die Immunantworten, die mit der Strahlentherapie und Hunden mit Nasentumoren verbunden sind. Wir versuchen zu verstehen, wie wir die Ergebnisse der Strahlentherapie bei Krebspatienten verbessern können, indem wir das Immunsystem modulieren. Verschiebungen in der Mikroumgebung des Immunsystems können bei der Untersuchung von Behandlungseffekten wichtig sein. Daher ist eine serielle Analyse der Zellen der Mikroumgebung erwünscht. Aufgrund der komplexen Anatomie und der Neigung der Schleimhaut zu Blutungen kann es jedoch schwierig sein, das Gewebe der Nasenhöhle mit wiederholten Biopsien zu entnehmen.

Die salzhaltige Nasenspültechnik ermöglicht eine serielle Probenahme der Immunmikroumgebung der Nasenhöhle mit minimaler Gewebezerstörung. Zellen und Proteine, die mit der Nasenspültechnik gesammelt wurden, können mit verschiedenen Assays analysiert werden, um den Status der nasalen Immunmikroumgebung im Laufe der Zeit zu untersuchen.

Füllen Sie einen Tag vor dem Eingriff 520-Milliliter-Spritzen mit steriler physiologischer Kochsalzlösung. Verschließen Sie die Spritzen fest und legen Sie sie in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius, um sie über Nacht zu erwärmen. Positionieren Sie dann das anästhesierte Hundeaußenliegen auf der Behandlungsliege. Stellen Sie den Kopf des Hundes so ein, dass er nach unten, natürlich und bequem von der Tischkante absteht, um eine optimale Probenentnahme für die Nasenspülung zu ermöglichen. Blasen Sie die Manschette des Endotrachealtubus auf, um eine dichte Abdichtung der Atemwege zu gewährleisten. Für die Nasenspülung schneiden Sie an der Basis einen sterilen roten Gummikatheter mit acht französischen Kathetern ab, der genau auf eine der vorgefüllten 20-Milliliter-Spritzen mit warmer Kochsalzlösung passt. Markieren Sie mit einem Permanentmarker das Basisende des Katheters, um den Startpunkt am Nasenlocheingang anzuzeigen. Vergewissern Sie sich, dass sich die vorgegebene Länge intranasal erstreckt und die Spitze an der gewünschten Stelle positioniert ist. Schneiden Sie anschließend die Katheterspitze so ab, dass sie der definierten intranasalen Katheterlänge entspricht, und stellen Sie sicher, dass sie an der richtigen Stelle in der Nasenhöhle landet. Um die Nasenspülung durchzuführen, bestimmen Sie eine Person, die den Katheter in die Nasenhöhle führt und verabreicht, und die andere Person, die Probe beim Austritt aus der Nase zu entnehmen. Positionieren Sie eine Person mit Handschuhen vor und unter dem Kopf des Hundes. Führen Sie den roten Gummikatheter vorsichtig in den medialen Aspekt der Nasenhöhle ein, bis die Markierung auf dem Katheter mit dem Nasenlocheingang ausgerichtet ist. Gleichzeitig hält die andere Person einen konischen 50-Milliliter-Schlauch unter das Nasenloch, wobei der Katheter an Ort und Stelle ist. Verschließen Sie mit einer Hand vorsichtig das kontralaterale Nasenloch. Beginnen Sie mit der Infusion der Kochsalzlösung in die Nasenhöhle mit langsamem, gleichmäßigem Druck oder mit einer Impulsinfusion, während Sie den Kopf des Hundes in einem Abwärtswinkel halten. Sammeln Sie die Abflussflüssigkeit in einem konischen 50-Milliliter-Schlauch, der sich unterhalb des Nasenlochs befindet. Lassen Sie den Hund nach dem Eingriff sich von der Narkose erholen, während Sie ihn mit dem Kopf nach unten nach außen liegend halten. Notieren Sie nun das Gesamtvolumen der gesammelten Nasenspülflüssigkeit im Verhältnis zur Gesamtmenge der infundierten Kochsalzlösung. Um die Probe zu verarbeiten, wirbeln oder pipettieren Sie die Nasenspülproben vorsichtig in den konischen Röhrchen, um Klumpen von Schmutz und Zellen aufzubrechen. Führen Sie die gepoolten Proben durch einen 70-Mikrometer-Küvettenfilter, um große Ablagerungen im Schleim zu entfernen. Zentrifugieren Sie die filtrierten Proben fünf bis 10 Minuten lang bei 300 g, um ein Zellpellet zu bilden. Saugen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette aus den Zentrifugenproben ab. Den Überstand für die anschließende Proteinanalyse in ein sauberes Röhrchen geben. Zum Schluss resuspendieren Sie die Zellpellets in PBS oder der bevorzugten Lösung für interessierende Zellassays.