Name: Bewertung von Glutamin als Brennstoffquelle für Alveolarmakrophagen, die chronischem Ethanol ausgesetzt sind, mit einem extrazellulären Flussbioanalysator (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-15T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Erfahren Sie, wie chronischer Ethanol die mitochondriale Atmung von Alveolarmakrophagen verändert und Glutamin als Brennstoffquelle nutzt. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare Messungen für Immunologie und Pharmakologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Ethanol beeinträchtigt die AM-Bioenergetik durch Verschiebung zur Glutamin-abhängigen Atmung

<ol><li>2021 National Survey on Drug Use and Health (NSDUH). Table 5.6A - Alcohol Use Disorder in Past Year: Among People Aged 12 or Older; by Age Group and Demographic Characteristics, Numbers in Thousands, 2021. , Substance Abuse and Mental Health Services Administration (SAMHSA). At
 <a target="_blank" href="https://www.samhsa.gov/data/sites/default/files/reports/rpt39441/NSDUHDetailedTabs2021/NSDUHDetailedTabs2021/NSDUHDetTabsSect5pe2021.htm">https://www.samhsa.gov/data/sites/default/files/reports/rpt39441/NSDUHDetailedTabs2021/NSDUHDetailedTabs2021/NSDUHDetTabsSect5pe2021.htm</a> (2021).</li>
<li>Everts, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+pneumonia+in+adult+general+medical+and+surgical+patients+at+Christchurch+Hospital%5BTitle%5D)+AND+%22N+Z+Med+J%22%5BJournal%5D)">Nosocomial pneumonia in adult general medical and surgical patients at Christchurch Hospital.</a> N Z Med J. 113 (1111), 221-224 (2000).</li>
<li>de Roux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+alcohol+abuse+in+the+etiology+and+severity+of+community-acquired+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Impact of alcohol abuse in the etiology and severity of community-acquired pneumonia.</a> Chest. 129 (5), 1219-1225 (2006).</li>
<li>Moss, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+sepsis%3A+race%2C+sex%2C+and+chronic+alcohol+abuse%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of sepsis: race, sex, and chronic alcohol abuse.</a> Clin Infect Dis. 41 (Suppl 7), S490-S497 (2005).</li>
<li>Fernandez-Sola, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+alcohol+intake+as+a+risk+and+prognostic+factor+for+community-acquired+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">High alcohol intake as a risk and prognostic factor for community-acquired pneumonia.</a> Arch Intern Med. 155 (15), 1649-1654 (1995).</li>
<li>Yeligar, S. M., Harris, F. L., Hart, C. M., Brown, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione+attenuates+ethanol-induced+alveolar+macrophage+oxidative+stress+and+dysfunction+by+downregulating+NADPH+oxidases%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Glutathione attenuates ethanol-induced alveolar macrophage oxidative stress and dysfunction by downregulating NADPH oxidases.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306 (5), L429-L441 (2014).</li>
<li>Yeligar, S. M., Mehta, A. J., Harris, F. L., Brown, L. A., Hart, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma+regulates+chronic+alcohol-induced+alveolar+macrophage+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Peroxisome proliferator-activated receptor gamma regulates chronic alcohol-induced alveolar macrophage dysfunction.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 55 (1), 35-46 (2016).</li>
<li>Liang, Y., Harris, F. L., Brown, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alcohol+induced+mitochondrial+oxidative+stress+and+alveolar+macrophage+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Alcohol induced mitochondrial oxidative stress and alveolar macrophage dysfunction.</a> Biomed Res Int. 2014, 371593(2014).</li>
<li>Liang, Y., Harris, F. L., Jones, D. P., Brown, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alcohol+induces+mitochondrial+redox+imbalance+in+alveolar+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Alcohol induces mitochondrial redox imbalance in alveolar macrophages.</a> Free Radic Biol Med. 65, 1427-1434 (2013).</li>
<li>Morris, N. L., Harris, F. L., Brown, L. A. S., Yeligar, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alcohol+induces+mitochondrial+derangements+in+alveolar+macrophages+by+upregulating+NADPH+oxidase+4%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol%22%5BJournal%5D)">Alcohol induces mitochondrial derangements in alveolar macrophages by upregulating NADPH oxidase 4.</a> Alcohol. 90, 27-38 (2021).</li>
<li>Crotty, K. M., Kabir, S. A., Chang, S. S., Mehta, A. J., Yeligar, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pioglitazone+reverses+alcohol-induced+alterations+in+alveolar+macrophage+mitochondrial+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin+Exp+Res+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Pioglitazone reverses alcohol-induced alterations in alveolar macrophage mitochondrial phenotype.</a> Alcohol Clin Exp Res (Hoboken). 48 (5), 810-826 (2024).</li>
<li>Demine, S., Renard, P., Arnould, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+uncoupling%3A+A+key+controller+of+biological+processes+in+physiology+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial uncoupling: A key controller of biological processes in physiology and diseases.</a> Cells. 8 (8), 795(2019).</li>
<li>Hill, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+cellular+bioenergetics+with+mitochondrial+quality+control+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Integration of cellular bioenergetics with mitochondrial quality control and autophagy.</a> Biol Chem. 393 (12), 1485-1512 (2012).</li>
<li>Chacko, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bioenergetic+Health+Index%3A+a+new+concept+in+mitochondrial+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Sci+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">The Bioenergetic Health Index: a new concept in mitochondrial translational research.</a> Clin Sci (Lond). 127 (6), 367-373 (2014).</li>
<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+mitochondrial+respiration+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+myeloid+progenitors+using+Seahorse+technology%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analyzing mitochondrial respiration of human induced pluripotent stem cell-derived myeloid progenitors using Seahorse technology.</a> STAR Protoc. 4 (1), 102073(2023).</li>
<li>Gu, X., Ma, Y., Liu, Y., Wan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mitochondrial+respiration+in+adherent+cells+by+Seahorse+XF96+Cell+Mito+Stress+Test%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measurement of mitochondrial respiration in adherent cells by Seahorse XF96 Cell Mito Stress Test.</a> STAR Protoc. 2 (1), 100245(2021).</li>
<li>Plitzko, B., Loesgen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+oxygen+consumption+rate+%28OCR%29+and+extracellular+acidification+rate+%28ECAR%29+in+culture+cells+for+assessment+of+the+energy+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism.</a> Bio Protoc. 8 (10), e2850(2018).</li>
<li>Winnica, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+differences+in+the+airway+epithelium+of+lean+versus+obese+asthmatics+are+driven+by+nitric+oxide+and+reflected+in+circulating+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic differences in the airway epithelium of lean versus obese asthmatics are driven by nitric oxide and reflected in circulating platelets.</a> Antioxid Redox Signal. 31 (10), 673-686 (2019).</li>
<li>Nickens, K. P., Wikstrom, J. D., Shirihai, O. S., Patierno, S. R., Ceryak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bioenergetic+profile+of+non-transformed+fibroblasts+uncovers+a+link+between+death-resistance+and+enhanced+spare+respiratory+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">A bioenergetic profile of non-transformed fibroblasts uncovers a link between death-resistance and enhanced spare respiratory capacity.</a> Mitochondrion. 13 (6), 662-667 (2013).</li>
<li>Mdaki, K. S., Larsen, T. D., Weaver, L. J., Baack, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age+related+bioenergetics+profiles+in+isolated+rat+cardiomyocytes+using+extracellular+flux+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Age related bioenergetics profiles in isolated rat cardiomyocytes using extracellular flux analyses.</a> PLoS One. 11 (2), e0149002(2016).</li>
<li>Dranka, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+bioenergetic+function+in+response+to+oxidative+stress+by+metabolic+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Assessing bioenergetic function in response to oxidative stress by metabolic profiling.</a> Free Radic Biol Med. 51 (9), 1621-1635 (2011).</li>
<li>Chacko, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+defining+distinct+bioenergetic+profiles+in+platelets%2C+lymphocytes%2C+monocytes%2C+and+neutrophils%2C+and+the+oxidative+burst+from+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood.</a> Lab Invest. 93 (6), 690-700 (2013).</li>
<li>Tyrrell, D. J., Bharadwaj, M. S., Jorgensen, M. J., Register, T. C., Molina, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+cell+respirometry+is+associated+with+skeletal+and+cardiac+muscle+bioenergetics%3A+Implications+for+a+minimally+invasive+biomarker+of+mitochondrial+health%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Blood cell respirometry is associated with skeletal and cardiac muscle bioenergetics: Implications for a minimally invasive biomarker of mitochondrial health.</a> Redox Biol. 10, 65-77 (2016).</li>
<li>Shah-Simpson, S., Pereira, C. F., Dumoulin, P. C., Caradonna, K. L., Burleigh, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+profiling+of+Trypanosoma+cruzi+life+stages+using+Seahorse+extracellular+flux+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic profiling of Trypanosoma cruzi life stages using Seahorse extracellular flux technology.</a> Mol Biochem Parasitol. 208 (2), 91-95 (2016).</li>
<li>Nicholls, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> J Vis Exp. 46, e2511(2010).</li>
<li>Chance, B., Williams, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+enzymes+in+oxidative+phosphorylation.+I.+Kinetics+of+oxygen+utilization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. I. Kinetics of oxygen utilization.</a> J Biol Chem. 217 (1), 383-393 (1955).</li>
<li>Gerencser, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+microplate-based+respirometry+with+correction+for+oxygen+diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion.</a> Anal Chem. 81 (16), 6868-6878 (2009).</li>
<li>Yeligar, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PPARgamma+regulates+mitochondrial+structure+and+function+and+human+pulmonary+artery+smooth+muscle+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">PPARgamma regulates mitochondrial structure and function and human pulmonary artery smooth muscle cell proliferation.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 58 (5), 648-657 (2018).</li>
<li>Yeligar, S., Tsukamoto, H., Kalra, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol-induced+expression+of+ET-1+and+ET-BR+in+liver+sinusoidal+endothelial+cells+and+human+endothelial+cells+involves+hypoxia-inducible+factor-1alpha+and+microrNA-199%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ethanol-induced expression of ET-1 and ET-BR in liver sinusoidal endothelial cells and human endothelial cells involves hypoxia-inducible factor-1alpha and microrNA-199.</a> J Immunol. 183 (8), 5232-5243 (2009).</li>
<li>Yeligar, S. M., Harris, F. L., Brown, L. A. S., Hart, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+reversal+of+post-transcriptional+alterations+implicated+in+alcohol-induced+alveolar+macrophage+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol%22%5BJournal%5D)">Pharmacological reversal of post-transcriptional alterations implicated in alcohol-induced alveolar macrophage dysfunction.</a> Alcohol. 106, 30-43 (2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>15 mL konisches Röhrchen&nbsp;</td><td>VWR International, Inc.</td><td>21008-670</td><td>Wird zur Herstellung von Stammkonzentrationen von Mitochondrien-bezogenen Reagenzien verwendet.</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich Co.</td><td>M6250</td><td>Wird zur Kultivierung von MH-S-Zellen verwendet.</td></tr><tr><td>Zellschaber</td><td>Dot Scientific, Inc.</td><td>70-1180</td><td>Wird zum Schaben von MH-S-Zellen aus T-75-Kolben verwendet.</td></tr><tr><td>Countess 3 FL Instrument: Zellzähler</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>AMQAF2000</td><td>Wird zum Zählen der Anzahl der MH-S-Zellen verwendet, die für Experimente auf die Platte gebracht werden.</td></tr><tr><td>D-Glukose&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich Co.</td><td>G8270</td><td>Wird für das extrazelluläre Flussmittel-Basismedium verwendet.</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>4355720</td><td>Experimentelle Behandlung von MH-S-Zellen.</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Sciencell Research Laboratories</td><td>500</td><td>Wird zur Kultivierung von MH-S-Zellen verwendet.</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma Aldrich Co.</td><td>G1397</td><td>Wird zur Kultivierung von MH-S-Zellen verwendet.</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>Wird für das extrazelluläre Flussmittel-Basismedium verwendet.</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 10.2.3</td><td>GraphPad Software</td><td>N/A</td><td>Software für statistische Analysen. Nach dem Kauf bei https://www.graphpad.com/features zum Download erhältlich.</td></tr><tr><td>MH-S-Zellen</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-2019</td><td>Maus-Alveolarmakrophagen-Zelllinie.</td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen&nbsp;</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>4036-3212</td><td>Wird zur Herstellung von Arbeitskonzentrationen von Mitochondrien-bezogenen Reagenzien verwendet.</td></tr><tr><td>Microsoft 365 Excel: Computer-Tabellenkalkulationsprogramm</td><td>Microsoft</td><td>N/A</td><td>Software für Datenorganisation und mitochondriale Bioenergetik-Berechnungen. Nach dem Kauf bei https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel herunterladbar.</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>15140122</td><td>Wird zur Kultivierung von MH-S-Zellen verwendet.</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>VWR International, Inc.</td><td>45000-446</td><td>Wird zum Waschen von MH-S-Zellen verwendet.</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>VWR International, Inc.</td><td>45000-396</td><td>Wird zur Kultivierung von MH-S-Zellen verwendet.</td></tr><tr><td>Seahorse Wave Pro Software: Computer-Softwareprogramm für das Design und die Analyse von Assays</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>N/A</td><td>Der Computer ist an das Seahorse XF Pro Analyzer angeschlossen. Herunterladbar unter&nbsp; https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-software/software-download-for-seahorse-wave-pro-software?productURL=https%3A%2F%2Fwww.agilent.com%2Fen%2Fproduct%2Fcell-analysis%2Freal-time-cell-metabolic-analysis%2Fxf-software%2Fseahorse-wave-pro-software-2007523.</td></tr><tr><td>Seahorse XF Base Medium: extrazelluläres Flussmittel-Basismedium, pH 7,4</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>103334-100</td><td>Wird zur Vorbereitung von Stamm- und Arbeitskonzentrationen von mitochondrienbezogenen Reagenzien und zur Kultivierung von MH-S-Zellen vor Versuchsläufen verwendet.</td></tr><tr><td>Seahorse XF Glutamin-Oxidations-Stresstest-Kit</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>103674-100</td><td>Enthält BPTES, Oligomycin, FCCP und Rotenon/Antimycin A.</td></tr><tr><td>Seahorse XF Pro Analyzer: Bioanalysator für extrazelluläre Flüsse</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>N/A</td><td>Bioanalysator für extrazelluläre Flussmittel.</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 FluxPak: 96-Well-Kartuschen für extrazelluläre Flux-Paks, 96-Well-Mikrokulturplatten für extrazelluläre Flux-Mikrokulturen und Kalibrierlösung</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>102416-100</td><td>Zur Vorbereitung von MH-S-Zellen für Assays mit einem extrazellulären Flussbioanalysator.</td></tr><tr><td>Serologische Pipette&nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnologie, Inc.</td><td>sc-550678</td><td>Wird zum Entfernen von Medien aus MH-S-Zellen verwendet.</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma Aldrich Co.</td><td>S6014</td><td>Zur Kultivierung von MH-S-Zellen.</td></tr><tr><td>Natriumpyruvat&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich Co.</td><td>P4562</td><td>Wird für das extrazelluläre Flussmittel-Basismedium verwendet.</td></tr><tr><td>T-75 Kolben</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-200263</td><td>Wird zur Kultivierung von MH-S-Zellen verwendet.</td></tr></tbody></table>

bewertung von glutamin als brennstoffquelle für alveolarmakrophagen, die chronischem ethanol ausgesetzt sind, mit einem extrazellulären flussbioanalysator

Assessment of Glutamine as a Fuel Source for Alveolar Macrophages Exposed to Chronic Ethanol Using an Extracellular Flux Bioanalyzer

Eine chronische EtOH-Exposition verringert die Glutaminabhängigkeit in MH-S-Zellen. Die Glutaminolyse ist ein kritischer Weg für die mitochondriale Atmung und unterstützt Glutamin als wichtige Brennstoffquelle für die zelluläre Bioenergetik. Um festzustellen, ob eine chronische Exposition gegenüber EtOH die Abhängigkeit von MH-S-Zellen von Glutamin als Brennstoffquelle für die mitochondriale Atmung verändert, wurden MH-S-Zellen ohne EtOH-Kontrolle (Con) oder EtOH behandelt, und die OCR wurde im Laufe der Zeit als Reaktion auf serielle Injektionen von Reagenzien gemessen, die mit der mitochondrialen Atmung assoziiert sind. Bioenergetische OCR-Profile als Reaktion auf serielle Injektionen von Oligomycin (ATP-Synthase-Inhibitor), FCCP (Protonen-Entkoppler) und R/A (mitochondriale Komplex I- bzw. Komplex III-Inhibitoren) werden verwendet, um andere Parameter der mitochondrialen Bioenergetik zu berechnen, wie z. B. ATP-gebundene Atmung, maximale Atmung und freie Atemkapazität. Bei allen gezeigten Daten handelt es sich um zusätzliche biologische Replikate von experimentellen Gruppen Con + media, Con + BPTES und EtOH + media, EtOH + BPTES MH-S-Zellen, die in Crotty et al.11 veröffentlicht wurden. Wie in Abbildung 2A gezeigt, verringerte Oligomycin die OCR aufgrund der Hemmung des Komplexes V, FCCP erhöhte die OCR aufgrund der mitochondrialen Entkopplung des Membranpotentials und der mitochondrienabhängigen ATP-Generation12 und R/A schaltete die mitochondrienabhängige OCR effektiv ab. Diese Profile der bioenergetischen OCR-Reaktionen auf die seriellen Injektionen stimmen mit dem Benutzerhandbuch zur Bewertung von mitochondrialem Stress unter Verwendung eines extrazellulären Flussbioanalysatorsüberein 13,14.
Nach der Messung der basalen OCR in Con- und EtOH-behandelten MH-S-Zellen wurde eine Injektion von Media Control oder BPTES, einem Inhibitor der Glutaminase 1, geladen. Con + Medien versus Con + BPTES MH-S Zellen und EtOH + Medien versus EtOH + BPTES MH-S Zellen zeigten keine Unterschiede in den bioenergetischen OCR-Profilen (Abbildung 2A). EtOH + BPTES MH-S-Zellen zeigten eine Abnahme der Glutamin-abhängigen Basalatmung im Vergleich zu Con + BPTES (Messung #4 im Vergleich zu Messung #3 in Abbildung 2A und Abbildung 2B), was darauf hindeutet, dass EtOH die basale Glutaminoxidation der MH-S-Zellen verringert und zur mitochondrialen Atmung beiträgt. EtOH + BPTES MH-S-Zellen zeigten im Vergleich zu Con + BPTES einen Verlust der Glutamin-abhängigen-ATP-gebundenen mitochondrialen Atmung (Abbildung 2C). Obwohl EtOH + BPTES MH-S-Zellen im Vergleich zu Con + BPTES einen abgestumpften Verlust der glutaminabhängigen maximalen Atmung zeigten (Abbildung 2D), zeigten EtOH + BPSTES MH-S-Zellen eine Abnahme der Glutamin-abhängigen freien Atmungskapazität im Vergleich zu Con + BPTES (Abbildung 2E). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass EtOH MH-S-Zellen die Fähigkeit haben, für die Atmung stärker von Glutamin abhängig zu sein, als wenn sie mit FCCP gestresst sind, aber dass sie dazu möglicherweise nicht in der Lage sind, da ein Anstieg des Glutaminbedarfs durch eine Abnahme der Glutamin-Bioverfügbarkeit aufgewogen wird.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67579/67579fig01.jpg"> 
Abbildung 1: Allgemeiner Überblick über den Arbeitsablauf zur Messung der glutaminabhängigen mitochondrialen Atmung und Bioenergetik in MH-S-Zellen, einer Alveolarmakrophagen-Zelllinie der Maus. Monolayer von MH-S-Zellen, die in extrazellulären Flussmittel-Mikrokulturplattenvertiefungen kultiviert wurden (Schritt 3.1), wurden mit extrazellulärem Flussmittel-Basismedium inkubiert und mit Zusätzen (Schritt 3.2) bei 37 °C in einem Nicht-CO2 -befeuchteten Inkubator für 30 min-1 h inkubiert (Schritt 3.4). Das extrazelluläre Flussmittel-Basismedium mit Zusätzen (Schritt 3.2) wurde als Medienkontrolle und zur Verdünnung der Arbeitskonzentrationen des Glutaminoxidationsinhibitors BPTES auf eine Endkonzentration von 3 μM, des mitochondrialen Komplex-V-Inhibitors Oligomycin (Oligo) auf eine Endkonzentration von 0,5 μM, des mitochondrialen Entkopplers Carbonylcyanid-p-trifluormethoxyphenylhydrazon (FCCP) auf eine Endkonzentration von 0,5 μM und der mitochondrialen Complex-I- und Complex-III-Inhibitoren Rotenon/Antimycin A (R/A) auf 0,5 μM verwendet Endkonzentration für die Ladeöffnungen A-D in der oberen extrazellulären Flussmittel-Pak-Kartusche (Schritt 3.7). Die Injektionsstrategie für Misch-, Warte- und Messzeiten für den Versuchslauf mit dem extrazellulären Flussbioanalysator lautete: 3 Minuten Mischzeit, 0 Minuten Wartezeit und 6 Messungen von 3 Minuten Messzeit für Anschluss A (Medienkontrolle oder BPTES); 3 min Mischzeit, 0 min Wartezeit und 3 Messungen à 3 min Messzeit für Port B (Oligo); 3 min Mischzeit, 6 min Wartezeit und 3 Messungen à 3 min Messzeit für Port C (FCCP); und 3 min Mischzeit, 0 min Wartezeit und 3 Messungen von 3 min Messzeit für Port D (R/A). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67579/67579fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67579/67579fig02.jpg"> 
Abbildung 2: Chronisches Ethanol (EtOH) verringert die glutaminabhängige mitochondriale Atmung in MH-S-Zellen, einer Alveolarmakrophagen-Zelllinie der Maus. MH-S-Zellen wurden unbehandelt (Con) oder mit EtOH (0,08 %, 72 h) behandelt, und die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) über die Zeit wurde mit einem extrazellulären Flussbioanalysator vor und nach der Injektion mit Medienkontrolle oder einem Glutamin (GLN)-Oxidationshemmer (3 μM BPTES) gemessen, gefolgt von seriellen Injektionen von mitochondrialen Komplex-V-Inhibitoren (0,5 μM Oligomycin, Oligo), mitochondrialer Entkoppler (0,5 μM Carbonylcyanid-p-trifluormethoxyphenylhydrazon, FCCP) und mitochondriale Inhibitoren des Komplexes I und des Komplexes III (0,5 μM Rotenon/0,5 μM Antimycin A, R/A). (A) Bioenergetische OCR-Profile wurden verwendet, um die glutaminabhängige (B) basale Atmung, (C) ATP-gebundene Atmung, (D) maximale Atmung und (E) freie Atemkapazität zu berechnen. Lineare Punkte stellen Mittelwerte ± SEM dar (n = 4, #p &lt; 0,05 gegenüber Con + Medien und *p &lt; 0,05 gegenüber Con + BPTES, unidirektionale ANOVA mit Tukeys Post-hoc). Die Balken stellen die Mittelwerte ± SEM dar (n = 4, *p &lt; 0,05 gegenüber Con + BPTES, Student's t-Test). Bei den vorgestellten Daten handelt es sich um zusätzliche biologische Replikate für die medienkontrollierten und BPTES-behandelten Versuchsgruppen von unbehandelten kontrollierten und chronischen EtOH-exponierten MH-S-Zellen, die in Crotty et al.11 veröffentlicht wurden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67579/67579fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Bewertung von Glutamin als Brennstoffquelle für Alveolarmakrophagen, die chronischem Ethanol ausgesetzt sind, mit einem extrazellulären Flussbioanalysator

Alveolar macrophages (AMs) are the first line of cellular defense in the lower airway against pathogens. However, chronic and excessive alcohol use ...

assessment-glutamine-as-fuel-source-for-alveolar-macrophages-exposed

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Stabile Isotope Profilierung mittels Gaschromatographie-Massenspektrometrie des Vermittlers Stoffwechselflusses ist in dem Fadenwurm...

Stabilen Isotopen Profiling von Intermediary Metabolic Flux in Entwicklungs-und Erwachsenen-Stadium Caenorhabditis elegans</em

Dieses Protokoll bietet einen biochemischen Ansatz zur Messung der extrazellulären Ansäuerungsrate (ECAR) und der Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) von primären leukämischen Zellen mit einem extrazellulären Fluss-Assay. Die Beurteilung des metabolischen Profils dieser Zellen hilft, ihre Bedürfnisse zu charakterisieren, was zu einer personalisierten Therapie führt.

Extrazellulärer Flux-Assay: Eine Methode zur Messung des metabolischen Profils von Zellen

Eine Beschreibung, wie Förster Resonance Energy Transfer integriert biologischen Sensoren (FIBS) zur in-situ-Kalibrierung Metabolic Profiling vorgestellt. Die FIBS kann verwendet werden, um die intrazellulären Spiegel von Metaboliten nicht-invasiv Unterstützung bei der Entwicklung von Stoffwechselmodelle und Hochdurchsatz-Screening von Bioprozess-Bedingungen zu messen.

FIBS-fähigen Nichtinvasive Metabolic Profiling

Metabolische Reprogrammierung ist ein Merkmal und eine Voraussetzung für die Polarisation von M1- und M2-Makrophagen. Dieses Manuskript beschreibt einen Assay zur Messung grundlegender Parameter der Glykolyse und der mitochondrialen Funktion in aus dem Knochenmark der Maus stammenden Makrophagen. Mit diesem Werkzeug kann untersucht werden, wie bestimmte Faktoren den Stoffwechsel und den Phänotyp des Makrophagen beeinflussen.

Metabolische Charakterisierung Polarized M1 und M2-Knochenmark-Makrophagen über die Echtzeit-Extrazelluläre Flußanalyse

Glykolyse ist ein definierender metabolischer Marker in mehreren biologischen Systemen. Die Überwachung der Glykolyse durch Messung des extrazellulären Flusses von H+ ist üblich, erfordert jedoch eine Korrektur, um quantitativ und eindeutig zu sein. Hier zeigen wir, wie extrazelluläre Flussdaten gesammelt und korrigiert werden können, um zwischen respiratorischen und glykolytischen Quellen der extrazellulären Versauerung zu unterscheiden.

Messung und Analyse von extrazellulären Säureproduktion zu ermitteln glykolytischen Rate

Hier präsentieren wir eine schrittweise Protokoll um die mitochondriale Atmung und glykolytische Funktion in Candida Albicans untersuchen mit ein zusätzliches Flussmittel-Analyzer.

Bio-Energetik-Untersuchung von Candida Albicans mittels Real-Time extrazelluläre Flux Analyse

Die Protokolle beschreiben Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-Methoden, gekoppelt an Brechungsindex oder massenspektrometrische Detektion zur Untersuchung von Stoffwechselreaktionen in komplexen lysatbasierten zellfreien Systemen.

Flüssigkeitschromatographie gekoppelt an Brechungsindex oder massenspektrometrische Detektion zur Metabolitenprofilierung in lysatbasierten zellfreien Systemen

Der Echtzeit-Zellstoffwechselfluss-Assay misst die Sauerstoffverbrauchsrate und die extrazelluläre Säuerungsrate, die der mitochondrialen und glykolytischen Adenosintriphosphatproduktion entspricht, unter Verwendung von pH- und Sauerstoffsensoren. Das Manuskript erklärt eine Methode zum Verständnis des Energiestatus von Osteoblasten und die Charakterisierung und Interpretation des zellulären bioenergetischen Status.

Verwendung eines Echtzeit-Zellstoffwechselflussanalysators zur Überwachung der Bioenergetik des Osteoblast

Hier beschreiben wir detailliert Methoden zur Extraktion von Makrophagen aus dem Knochenmark, der Milz und dem infarktierten Herzen und zur anschließenden Bestimmung des metabolischen Flusses in lebenden Zellen.

Analyse des ex vivo metabolischen Flusses in Milz- und Herzmakrophagen und Knochenmarkmonozyten

Dieses Protokoll beschreibt eine kosteneffiziente Methode zur Durchführung eines Glykolyse-Stresstests zur Quantifizierung der metabolischen Umprogrammierung in primären Maus-Mikroglia. Nach Isolierung und entzündlicher Stimulation wird die extrazelluläre Versauerungsrate (ECAR) mit frisch hergestellten, pH-angepassten Reagenzien gemessen, gefolgt von einer Proteinnormalisierung, um eine genaue und reproduzierbare Bewertung glykolytischer Verschiebungen zu ermöglichen.

Untersuchung der Glykolyse in primären Mikroglia mittels extrazellulärem Flussassay

Erfahren Sie, wie chronischer Ethanol die mitochondriale Atmung von Alveolarmakrophagen verändert und Glutamin als Brennstoffquelle nutzt. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare Messungen für Immunologie und Pharmakologie.

Bewertung von Glutamin als Brennstoffquelle für Alveolarmakrophagen, die chronischem Ethanol ausgesetzt sind, mit einem extrazellulären Flussbioanalysator (Video) | JoVE Journal

Bewertung von Glutamin als Brennstoffquelle für Alveolarmakrophagen, die chronischem Ethanol ausgesetzt sind, mit einem extrazellulären Flussbioanalysator

Weitere Videos entdecken