Aufreinigung, Expansion und durchflusszytometrische Phänotypisierung von mesenchymalen Stammzellen aus dem Knochenmark der Maus

Unsere Forschung bietet eine kostengünstige Methode zur Reinigung und Expansion homogener mesenchymaler Stammzellen des Knochenmarks von Mäusen. Dies hilft den Forschern, ausreichend hochwertige Zellen mit starken Wachstums- und Differenzierungsfähigkeiten zu erhalten. Eine zentrale Herausforderung in der Knochenmarkstammzellforschung besteht darin, ein einfaches und effektives Protokoll für die Isolierung mesenchymaler Stammzellen des Knochenmarks zu entwickeln. Diese Methode lässt mesenchymale Stammzellen des Knochenmarks lateral wachsen, ohne gestört zu werden. Es verwendet die dritte Passage, vermeidet zusätzliche Wachstumseffekte und hält hämatopoetische Zellen in der Nähe, um die Gesundheit und Funktion der Stammzellen zu unterstützen.

[Dozent] Weichen Sie die euthanasierte Maus zunächst fünf Minuten lang in 75% Ethanol ein. Machen Sie mit einer sterilen Präparierschere einen etwa einen Zentimeter großen Schnitt an der hinteren Extremität, in der Nähe der Achillessehne. Führen Sie dann einen kreisförmigen Schnitt um die hintere Extremität durch, um die distale Tibia freizulegen. Schälen Sie die Haut von der Inzisionsstelle nach oben in Richtung Hüfte, um die Haut von beiden Hintergliedmaßen zu entfernen. Schneiden Sie entlang des Beckenknochens, um den Hüftkopf vom Hüftknochen zu lösen. Entfernen Sie mit einem sterilen Skalpell so viel Sehne und Muskeln wie möglich aus dem Schien- und Wadenbein, um eine spätere Rötung zu erleichtern. Legen Sie die gereinigten Knochen wieder in die Schale, die PBS mit 2 % Penicillin und Streptomycin enthält, bevor Sie sie in eine sterile Haube geben. Nehmen Sie eine 50-Milliliter-Spritze und befestigen Sie die Nadel, die mit der Spritze geliefert wird. Füllen Sie die Spritze mit 20 Millilitern alpha MEM Medium und ersetzen Sie die Nadel durch die Nadel, die mit der Ein-Milliliter-Spritze geliefert wird. Schneiden Sie in der sterilen Haube mit einer Schere beide Enden des abgetrennten Oberschenkelknochens oder des Schienbeins ab. Führen Sie nun die Nadel an der Schnittkante in den Knochen ein und spülen Sie das Knochenmark in eine 100 Millimeter große Zellkulturschale, in der sich das komplette alpha MEM Medium befindet. Setzen Sie die Spülung fort, bis der Knochen sichtbar blass wird, was auf eine erfolgreiche Knochenmarkentnahme hinweist. Pipettieren Sie 40 Mal mit einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze auf und ab, um Zellaggregate zu dispergieren. Filtrieren Sie nun die Zellsuspension durch ein 40-Mikrometer-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, um Ablagerungen, Gewebefragmente und undispergierte Klumpen zu entfernen. Stellen Sie das Gesamtvolumen auf 15 Milliliter mit vollständigem alpha MEM-Medium ein und überführen Sie die gefilterte Zellsuspension in eine 100-Millimeter-Kulturschale. Halten Sie die Schale mit beiden Händen fest und schwenken Sie sie vorsichtig 15 Mal in einer Achterbewegung, um die Zellen gleichmäßig über die Schale zu verteilen. Zum Schluss stellen Sie die Kulturschale in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid und kulturieren sie fünf Tage lang. Diese Abbildung veranschaulicht den morphologischen Verlauf von Knochenmarkstromazellen von der ersten Extraktion bis zur dritten Passage in Kultur. Frisch extrahierte Knochenmarkzellen erschienen überwiegend mononukleär mit verstreuten Fetttröpfchen, die im gesamten Feld sichtbar waren. Am fünften Tag der Kultur begannen spindelförmige Zellen zu entstehen und erreichten eine Konfluenz von etwa 60 % bis 80 %, wobei die Dichte bis zum siebten Tag weiter zunahm. Von Passage eins bis Passage drei behielten die Stromazellen des Knochenmarks eine spindel- oder fusiforme Morphologie bei, bildeten eine klare Monoschicht mit miteinander verbundenen Kolonien und zeigten keine Anzeichen von Apoptose wie zytoplasmatische Granularität oder Kernfragmentierung. Die Durchflusszytometrie bestätigte, dass CD29, CD44 und Sca-1 in Stromazellen des Knochenmarks stark exprimiert wurden. Die Expression von CD31- und CD45-Markern der endothelialen und hämatopoetischen Linien war vernachlässigbar. Die Markerquantifizierung bestätigte außerdem hohe Expressionsniveaus von CD29, CD44 und Sca-1 im Vergleich zu CD31 und CD45.