Bewertung der Zelltodsignalisierung durch Immunfluoreszenz in einem Rattenmodell für ischämische Schlaganfälle

Ratten-In-vivo-Modelle sind unverzichtbare Werkzeuge, um die pathologischen Mechanismen und therapeutischen Ziele des ischämischen Schlaganfalls zu untersuchen. In dieser Arbeit wird die Durchführung von Immunfluoreszenzfärbungen in infarktierten Hirnschnitten nach einem Verschluss der mittleren Hirnarterie (MCAO) bei Ratten beschrieben.

Der ischämische Schlaganfall ist weltweit die häufigste Todesursache und Behinderung. Unsere Arbeit konzentriert sich auf Wirkstoffziele für Schlaganfälle. Wir interessieren uns für mehrere aufstrebende Ziele wie RUNX1 und Cathepsine. Um diese Ziele zu evaluieren, haben wir ein Rattenmodell für ischämische Schlaganfälle entwickelt, indem wir die mittlere Hirnarterie verschlossen haben.

Wir modellieren den ischämischen Schlaganfall bei Ratten, indem wir ein Filament einführen, um die mittlere Hirnarterie zu verschließen. Das Modell des Verschlussmodells der mittleren Hirnarterie ist das am häufigsten verwendete Nagetiermodell für präklinische Schlaganfallstudien in Kombination mit anderen Techniken wie TTC, Immunfluoreszenz und der TUNEL-Färbung. Wir können die Pathophysiologie des Schlaganfalls in einem integrierten Ansatz erforschen. Es gibt einige technische Herausforderungen für die Immunfluoreszenz, wie z. B. die Spezifität von Antikörpern, die Minimierung des Fluoreszenzhintergrunds und die Optimierung des Signal-Rausch-Verhältnisses durch die Nutzung der Eigenschaften von fluoreszierenden Markierungen und der spezifischen Antikörper. Die Immunfluoreszenz ermöglicht es uns, die komplizierte Landschaft der zellulären Architektur und die molekularen Wechselwirkungen mit dem Modell des Verschlussmodells der mittleren Hirnarterie zu verstehen.

Eine Reihe von Hirngewebe kann möglicherweise mit einem geeigneten Zeitfenster des Schlaganfalls gerettet werden. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Expression von Cathepsin B in der Anzahl der Rattengehirne nach einem Verschluss der mittleren Hirnarterie aktiviert ist. Sie geht mit einer vermehrten Apoptose einher. Weitere Studien über den Mechanismus, der der Zelltodsignalisierung zugrunde liegt, könnten ein neues Ziel für ein Medikament bieten.

In unserer zukünftigen Studie werden wir weiterhin potenzielle molekulare Angriffspunkte in Entzündungswegen und Zelltodsignalen untersuchen. Wir hoffen, dass einige dieser Ziele, die in experimentellen Studien entdeckt wurden, in die klinische Therapie übertragen werden können, um so das Überleben und die Lebensqualität von Schlaganfallpatienten zu verbessern.

[Erzähler] Zu Beginn bringen Sie die anästhesierte Ratte in Rückenlage und halten Sie ihre Körpertemperatur mit einer geregelten Heizmatte und einer rektalen Temperaturüberwachungssonde auf 36,5 °C. Rasieren Sie die Haut am Hals und desinfizieren Sie sie mit einer Iodophor-Desinfektionslösung. Machen Sie als Nächstes einen 2 cm langen Schnitt in der Mittellinie im Hals und ziehen Sie die Weichteile zurück, um die Halsschlagadern freizulegen. Isolieren Sie mit einer Pinzette die rechte Arteria carotis communis (CCA), die Arteria carotis externa (ECA) und die Arteria carotis interna (ICA). Lilizieren Sie die proximale rechte CCA mit Nähten. Klemmen Sie dann die richtigen ICA und ECA mit einem Mikroclip an ihren Ursprung. Führen Sie ein mit einer runden Silikonspitze beschichtetes Nylon-Monofilament durch einen kleinen Schnitt in das Lumen des CCA ein und binden Sie einen Knoten in das CCA, um ein Ausbluten und Lösen des Monofilaments zu verhindern. Öffnen Sie den rechten ICA-Mikroclip und führen Sie das Monofilament durch den ICA-Stumpf in die rechte mittlere Hirnarterie (MCA) ein, bis die Silikonspitze den Ursprung des MCA verschließt. Schneiden Sie den freiliegenden Teil des Nylon-Monofilaments ab und schließen Sie den Mittelschnitt am Hals. Öffnen Sie nach zwei Stunden MCA-Okklusion den Halsschnitt und lösen Sie den Knoten im CCA. Ziehen Sie dann das Nylon-Monofil heraus, um das MCA zu reperfusionieren. Beobachten Sie die Ratte nach der Operation während der Genesung von der Narkose in einem beheizten Käfig, der mit einer temperaturgeregelten Heizmatte gehalten wird. Bewerten Sie die neurologische Funktion anhand der Zaya Long Behavioral Rating Scale zwei Stunden nach dem Verschluss der mittleren Hirnarterie (MCAO) und 22 Stunden nach der Reperfusion. Nachdem Sie das gesamte Gehirn von der MCAO-Modellratte isoliert haben, frieren Sie das Gehirn 20 Minuten lang bei -20 °C ein. Schneiden Sie das gefrorene Gehirn in sechs koronale Scheiben mit einem Abstand von 2 mm zwischen den Scheiben. Die Scheiben mit 2% TTC 15 Minuten bei 37 °C im Dunkeln einfärben. Anschließend fixieren Sie die Hirnscheiben mit 4% Paraformaldehyd für 24 Stunden bei Raumtemperatur. Fotografieren Sie die fleckigen Scheiben mit einer Digitalkamera, die auf den Automatikmodus für Nahaufnahmen eingestellt ist. Übertragen Sie die Bilder auf einen Computer und verwenden Sie die ImageJ-Software, um die Infarktgröße zu messen. Berechnen Sie die Infarktgröße als das Verhältnis der Summe der Infarktfläche in allen sechs Schichten zur Summe der gesamten Hirnfläche in denselben Schichten. In der MCAO-Gruppe wurden signifikante Infarktgebiete beobachtet, verglichen mit keinem Infarkt in der Scheingruppe. Für die Immunfluoreszenzanalyse fixieren Sie das intakte Gehirn der MCAO-Modellratte 24 Stunden lang in 4 % Paraformaldehyd. Dehydrieren Sie dann das Gehirn in einer Reihe von Saccharoselösungsgradienten in Konzentrationen von 10 %, 15 % und 30 %, in Konzentrationen von 10 %, 15 % und 30 %, bis das Gewebe absinkt. Betten Sie das dehydrierte Gehirn in eine Mischung mit optimaler Schnitttemperatur ein und entfernen Sie alle Luftblasen. Schnappschuss frieren Sie das Gehirn in flüssigem Stickstoff ein. Auf einem Kryostaten wird das Gehirn mit einer Dicke von 5 μm geschnitten. Nachdem Sie die gefrorenen Hirnschnitte bei Raumtemperatur äquilibriert haben, waschen Sie sie dreimal mit sterilem PBS für jeweils 5 Minuten. Das Gewebe wird mit einem immunhistochemischen Stift umrissen, bevor es 10 Minuten lang mit 20 μg Proteinase K und 0,3 % Triton X-100 bei Raumtemperatur inkubiert wird. Nach dem Waschen der Schnitte mit PBS 3% BSA auf das umrissene Gewebe auftragen und eine Stunde lang bei Raumtemperatur zum Blockieren inkubieren. Die Blockierungslösung wird durch den entsprechenden Primärantikörper ersetzt und die Schnitte über Nacht im Dunkeln bei 4 °C inkubiert. Waschen Sie die Schnitte am nächsten Tag dreimal mit sterilem PBS mit 0,1 % Tween-20 für jeweils 5 Minuten. Geben Sie den entsprechenden Sekundärantikörper hinzu, der an das erforderliche Fluorophor konjugiert ist, und inkubieren Sie die Schnitte eine Stunde lang in einer befeuchteten Kammer, um sie vor Licht zu schützen. Nach dem Waschen der Abschnitte mit PBS, das Tween-20 enthält, färben Sie sie mit einem Einbettmedium, das DAPPI enthält, und decken Sie sie mit Deckgläsern ab. Stellen Sie an einem Fluoreszenzmikroskop die Anregungswellenlänge auf 488 nm, die Emissionswellenlänge auf 520 nm und die Belichtungszeit auf 500 ms ein, um gefärbte Hirnschnitte zu erfassen.Zeitalter. Die Cathepsin-B-Immunreaktivität war im ischämischen Kern der MCAO-Gruppe im Vergleich zur Scheingruppe signifikant erhöht. Die Cathepsin-B-Immunreaktivität war in der Penumbra-Kortex der MCAO-Gruppe im Vergleich zur Scheingruppe signifikant erhöht. Es wurde kein signifikanter Unterschied in der Cathepsin-B-Immunreaktivität zwischen dem ischämischen Kern und dem Halbschattenkortex beobachtet. Dehydrieren Sie zunächst die paraformaldehyd-fixierten Hirnschnitte der MCAO-Modellratte in erhöhter Ethanolkonzentration für jeweils 35 bis 50 Minuten. Behandeln Sie dann die Gehirnschnitte 35 bis 50 Minuten lang mit Terpentinöl Typ transparentem biologischem Mittel 1, gefolgt von Klärmittel 2 für 35 bis 50 Minuten, bis das Gewebe vollständig transparent ist. Tauchen Sie nun die Gehirnschnitte nacheinander 60 Minuten nacheinander in die Einbettmedien 1, 2, 3 und 4. Legen Sie die Hirnschnitte in eine Einbettkassette, verschließen Sie sie fest und lagern Sie sie zur Verfestigung in einem Kühlhaus. Schneiden Sie den Gewebeblock mit dem Mikrotom bei 10 μm ab und schneiden Sie ihn dann bei 5 μm. Lassen Sie die Gewebeschnitte 30 Sekunden lang in einem 45 °C warmen Wasserbad schwimmen und übertragen Sie sie anschließend auf Objektträger. Nach dem Trocknen entparaffinieren Sie die Hirnabschnitte in einem Clearingmittel für zwei Zyklen à 10 Minuten. Rehydrieren Sie dann die Gehirnabschnitte in abnehmender Ethanolkonzentration. Spülen Sie den Abschnitt nun dreimal für jeweils fünf Minuten in PBS aus. Nachdem Sie die überschüssige Feuchtigkeit entfernt haben, fügen Sie jedem Abschnitt 100 μl Proteinase K hinzu und inkubieren Sie 20 Minuten lang bei 37 °C. Nach dem Waschen von PBS werden 100 μl terminaler Desoxynukleotidyltransferase-Äquilibrierungspuffer auf jede Probe aufgetragen und in einer befeuchteten Kammer bei 37 °C für 10 bis 30 Minuten inkubiert. Entfernen Sie den Puffer mit saugfähigem Papier und fügen Sie 50 μl Markierungsarbeitslösung aus dem TUNEL-Assay-Kit hinzu. Tragen Sie anschließend die DIPPI-Arbeitslösung auf die Schnitte auf und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang im Dunkeln, um die Zellkerne gegenzufärben. Spülen Sie die Proben viermal für jeweils 5 Minuten in PBS. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit und versiegeln Sie den Objektträger mit einem lichtbeständigen Einbettmedium. Scannen Sie den gefärbten Objektträger mit dem multispektralen Bildgebungssystem Vectra Polaris. Die TUNEL-Färbung zeigte einen signifikanten Anstieg der Apoptose, mit mehr TUNEL-positiven Zellen in der Halbschattenrinde der MCAO-Gruppe im Vergleich zur Scheingruppe.