Name: Bildgebung und Quantifizierung der mitochondrialen Morphologie bei C. elegans während des Alterns (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-17T14:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 29 s
Description: Lernen Sie die Bildgebung und Quantifizierung der mitochondrialen Morphologie bei C. elegans während des Alterns. Diese Methode nutzt fluoreszente Mikroskopie, um gewebespezifische Veränderungen zu analysieren.

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<meta charset="utf8"></head><body>Analyse der mitochondrialen Morphologie in C. elegans

<table><tbody><tr><td>5-Fluor-2'-Desoxyuridin (FUDR)</td><td>Spectrum Chemical</td><td>F2026-10GMBL</td><td>zur Proliferationshemmung</td></tr><tr><td>APEX IPTG</td><td>Genesee</td><td>18-242</td><td>für RNAi</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>VWR</td><td>90000-764</td><td>für NGM-Platten</td></tr><tr><td>Bacto Pepton</td><td>VWR</td><td>97064-330</td><td>für NGM-Platten</td></tr><tr><td>Calciumchlorid-Dihydrat</td><td>VWR</td><td>97061-904</td><td>für NGM-Platten</td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>VWR</td><td>76345-522</td><td>für RNAi-Cholesterin</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>80057-932</td><td>für NGM-Platten</td></tr><tr><td>Konfokales Mikroskop&nbsp;</td><td>Stellaris 5</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>VWR</td><td>BDH1115-1LP</td><td>Lösungsmittel für Medikamente</td></tr><tr><td>HistoBond Objektträger</td><td>VWR</td><td>16005-110</td><td>für die Objektpräparation</td></tr><tr><td>LB Bouillon</td><td>VWR</td><td>95020-778</td><td>für LB</td></tr><tr><td>LEICA S7E Präparierfernrohr</td><td>Leica</td><td>10450840</td><td>Standard Präpariermikroskop</td></tr><tr><td>LEICA STELLARIS 5</td><td>Leica</td><td>158101100</td><td>Konfokalmikroskop</td></tr><tr><td>LEICA THUNDER</td><td>Leica</td><td>11525679</td><td>Verbindungsmikroskop</td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat-Heptahydrat</td><td>VWR</td><td>97062-132</td><td>für NGM-Platten, M9</td></tr><tr><td>pL4440 leeres Vektorplasmid</td><td>Addgenplasmid</td><td>#1654</td><td>für leeres Vektorplasmid</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>VWR</td><td>97061-566</td><td>für Bleichlösung</td></tr><tr><td>Kalium Phosphat zweibasisch</td><td>VWR</td><td>EM-PX1570-2</td><td>für NGM-Platten</td></tr><tr><td>Kaliumphosphat monobasisch</td><td>VWR</td><td>EM-PX1565-5</td><td>für M9</td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>VWR</td><td>97064-646</td><td>für lähmende Würmer</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>VWR</td><td>EM-SX0420-5</td><td>für NGM-Platten, M9</td></tr><tr><td>Natriumhypochlorit</td><td>VWR</td><td>RC7495.7-32</td><td>für Bleichlösung</td></tr><tr><td>Natriumphosphat zweibasisch</td><td>VWR</td><td>71003-472</td><td>für M9</td></tr><tr><td>Tetracyclinhydrochlorid</td><td>VWR</td><td>97061-638</td><td>für RNAi</td></tr><tr><td>WOB-L&not; &AElig; Trockene Vakuumpumpen, Standard-Duty, Welch&not; &AElig;</td><td>VWR</td><td>80077-612</td><td>für Aspiration</td></tr></tbody></table>

bildgebung und quantifizierung der mitochondrialen morphologie bei c. elegans während des alterns

Imaging and Quantifying Mitochondrial Morphology in C. elegans During Aging

C. elegans ist aufgrund seines transparenten Körpers, der eine einfache Bildgebung von ganzen Würmern und lebenden Tieren ohne übermäßige Probenvorbereitung ermöglicht, ein großartiges Modell für die mitochondriale Bildgebung. Darüber hinaus kann die mitochondriale Morphologie in verschiedenen Geweben leicht visualisiert werden, indem gewebespezifische Promotoren verwendet werden, um auf Mitochondrien ausgerichtete fluoreszierende Proteine zu exprimieren. Hier wurden myo-3p (für Muskelmitochondrien), vha-6p (für intestinale Mitochondrien) und col-19p (für subdermale Mitochondrien) verwendet, um die Expression eines auf Mitochondrien ausgerichteten GFP (mitochondriale Lokalisationssequenz des ATP-1-Proteins) zu steuern. Die Mitochondrien der Körperwandmuskulatur von C. elegans weisen eine röhrenförmige Morphologie auf, die sich entlang der Muskelfasern (Myofibrillen) ausrichtet (Abbildung 1A); Die intestinalen Mitochondrien zeigten stark miteinander verbundene, netzartige Strukturen mit weniger gleichmäßiger Ausrichtung (Abbildung 1B); und die Hypodermis hat röhrenförmige Mitochondrien, die im Vergleich zum Darm oder Muskel runder oder ovaler erscheinen (Abbildung 1C). Die mitochondriale Morphologie ist im Allgemeinen über die gesamte Länge des Wurms in den Muskeln und im Darm konsistent, aber die Hypodermis weist einige geringfügige Unterschiede in der Vernetzung der Mitochondrien zwischen den proximalen und distalen Enden des Wurms auf. Um reproduzierbare experimentelle Ergebnisse zu erzielen, empfiehlt es sich daher, sich auf eine bestimmte Region ihres Körpers zu konzentrieren. Dabei wird der Bereich zwischen dem Pharynx und der Vulva ~100-200 μm unterhalb des Pharynx konsistent abgebildet.
Bei Muskel- und hypodermalen Mitochondrien bietet die Bildgebung unter einem Verbundmikroskop aufgrund der Flachheit der Zellen und des geringen unscharfen Lichts eine ausreichende Auflösung. Darmmitochondrien sind jedoch mit einem Verbundmikroskop schwer zu beobachten, da das große Volumen des Darms die Auflösung aufgrund einer großen Menge an unscharfem Licht aus anderen Bereichen des Darms einschränkt (Abbildung 2). Daher wird empfohlen, die Darmmitochondrien unter einem konfokalen Mikroskop abzubilden, um unscharfes Licht zu reduzieren und die richtige mitochondriale Morphologie sichtbar zu machen.
Die Form der Mitochondrien ist hochdynamisch und ändert sich je nach dem metabolischen Milieu der Tiere23 oder sogar aufgrund der Exposition gegenüber variablen Substratsteifigkeiten24. Daher kann das Belassen von Tieren auf Objektträgern über einen längeren Zeitraum ohne Nahrungsquelle und auf dem steifen Substrat aus Glas möglicherweise die mitochondriale Morphologie beeinflussen. Hier ergab diese Studie, dass die Mitochondrien von Würmern nach etwa 30 Minuten auf einem Objektträger in M9-Lösung fragmentieren, wobei die subdermalen Mitochondrien die stärkste Fragmentierung aufwiesen (Abbildung 3). Daher sollte die Bildgebung der Mitochondrien schnell nach der Probenvorbereitung durchgeführt werden.
Chemikalien, die die Beweglichkeit der Würmer einschränken, einschließlich Natriumazid und Tetramisol, werden häufig für die Live-Bildgebung von C. elegans verwendet, da stationäre Würmer erforderlich sind, um mehrere Z-Schnitte von Tieren für die 3D-Bildgebung zu erfassen. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Exposition gegenüber Natriumazid oder Tetramisol zu einer mitochondrialen Fragmentierung führen kann25. Überraschenderweise zeigte sich, dass Natriumazid - selbst in hohen Konzentrationen - nur einen begrenzten Einfluss auf die mitochondriale Morphologie im Muskel oder Darm hatte. Die Hypodermis zeigte jedoch eine frühere mitochondriale Fragmentierung als die M9-Kontrollen (Abbildung 3). Wichtig ist, dass hohe Konzentrationen von Tetramisol (100 mM) in allen Zelltypen unmittelbar nach der Exposition zu einer signifikanten mitochondrialen Fragmentierung führten. Im Vergleich dazu führten mittlere Konzentrationen (10 mM) zu einer schnelleren Fragmentierung im Vergleich zu einer M9-Kontrolle. Niedrige Konzentrationen (1 mM) hatten einen begrenzten Einfluss auf die mitochondriale Morphologie. Diese Daten deuten darauf hin, dass die Verwendung von Natriumazid eine praktikable Option für die schnelle Bildgebung von Mitochondrien sein kann, während Tetramisol im Allgemeinen vermieden werden sollte.
Erwartungsgemäß zeigen die Mitochondrien aller Gewebe von C. elegans während des natürlichen Alterungsprozesses eine Fragmentierung (Abbildung 4A). Die Fragmentierung kann als Mitochondrien visualisiert werden, die sich als stumpfe und kugelförmige Strukturen präsentieren, die sich dramatisch von den linearen, röhrenförmigen Mitochondrien unterscheiden, die bei Jungtieren zu sehen sind. Es ist wichtig zu beachten, dass der Darm in einem späteren Alter an sphärischen autofluoreszierenden Strukturen zunimmt, so dass darauf geachtet werden muss, dass die Autofluoreszenz nicht mit tatsächlichen mitochondrialen Strukturen verwechselt wird. Da es eine Variabilität der Veränderungen in der mitochondrialen Struktur bei Würmern geben kann, ist es wichtig, die Quantifizierung der mitochondrialen Morphologie an einer signifikanten Stichprobengröße durchzuführen, anstatt nur einige wenige Würmer abzubilden. Hier wurde mitoMAPR verwendet, das eine automatisierte Quantifizierung der mitochondrialen Morphologie anhand einer Vielzahl von Metriken ermöglicht, darunter Objekte, Netzwerke, Verbindungen pro Netzwerk, Verbindungspunkte, Objektlänge, mitochondrialer Fußabdruck, mitochondriale Abdeckung und Objektfläche (Ergänzende Tabelle 1 und Ergänzende Tabelle 2). Die Automatisierung beseitigt subjektive Vorurteile beim Benutzer. Hier berichten wir, dass die Objektlängenmetrik optimal ist, um die Veränderungen der mitochondrialen Morphologie von Muskeln und Darm während des Alterns quantitativ zu messen, und die Verbindungspunktmetrik, um die Veränderungen der hypodermalen mitochondrialen Morphologie während des Alterns zu messen (Abbildung 4B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67610/67610fig01.jpg"> 
Abbildung 1: Bilder von Mitochondrien im gesamten Körper von C. elegans. Die mitochondriale Bildgebung wurde über die gesamte Länge von adulten Tieren an Tag 5 durchgeführt, die auf EV aus dem L1-Stadium gezüchtet wurden, bei transgenen Tieren mit MLS::GFP-Expression im Muskel (A), Darm (B) und in der Hypodermis (C). Maßstab: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/67610fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67610/67610fig02.jpg"> 
Abbildung 2: Vergleich der mitochondrialen Bildgebung zwischen Verbundmikroskop und Konfokalmikroskop. Die mitochondriale Bildgebung wurde an adulten Tieren am Tag 1 durchgeführt, die auf EV aus dem L1-Stadium gezüchtet wurden, in transgenen Tieren mit MLS::GFP-Expression im Muskel (A), Darm (B) und in der Hypodermis (C). Maßstab: 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/67610fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67610/67610fig03.jpg"> 
Abbildung 3: Beurteilung der mitochondrialen Fragmentierung verschiedener Gewebe nach Behandlung mit M9, Natriumazid und Tetramisol. Mitochondriale Bildgebung wurde an adulten Tieren am Tag 1 mit Expression von MLS::GFP in Muskeln, Darm und Hypodermis durchgeführt. Die Tiere wurden ab der L1-Stufe auf EV gezüchtet. Die Tiere wurden auf Objektträger gelegt, die M9, Natriumazid (1 mM, 10 mM und 100 mM) oder Tetramisol (1 mM, 10 mM und 100 mM) enthielten, und die Bildgebung wurde unmittelbar nach der Objektträgervorbereitung (0 min) oder 15 min oder 30 min nach der Objektträgervorbereitung durchgeführt. Repräsentative Bilder sind für n &gt; 5 Tiere pro Stamm für 2 biologische Replikate zu sehen. Maßstabsleisten: 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/67610fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67610/67610fig04.jpg"> 
Abbildung 4: Mitochondriale Bildgebung von C. elegans während des Alterns in verschiedenen Geweben und Quantifizierung der mitochondrialen Morphologie mittels MitoMAPR. (A) Die mitochondriale Bildgebung wurde an erwachsenen Tieren an den Tagen 1, 5, 9, 13 und 15 des Erwachsenenalters mit Expression von MLS::GFP in den Muskeln, im Darm und in der Hypodermis durchgeführt. Die Tiere wurden auf EV aus dem L1-Stadium gezüchtet und auf EV-Platten mit FUDR aus dem adulten Tagesstadium 1 gebracht. Die Bilder sind repräsentativ für n ≥ 5 Tiere pro Stamm für ≥ 3 biologische Replikate. Maßstab: 5 μm. (B) Die Quantifizierung der Objektlänge von Muskelmitochondrien und Darmmitochondrien von Würmern an den Tagen 1, 5, 9, 13 und 15 und die Quantifizierung der Verbindungspunkte der hypodermalen Mitochondrien von Würmern an den Tagen 1, 5, 9, 13 und 15. Alle einzelnen Datenpunkte in Kombination mit dem Mittelwert ± SD. Graphen wurden mit Hilfe eines studentischen t-Tests grafisch dargestellt und statistisch analysiert. ns = nicht signifikant, *p &lt; 0,03; **p &lt; 0,002; p &lt; 0,0002; p &lt; 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/67610fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tage der Würmer</td>
			<td>Anzahl der Würmer</td>
			<td>Volumen des Puffers (ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>25</td>
			<td>13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>25</td>
			<td>14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td>20</td>
			<td>15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13</td>
			<td>20</td>
			<td>15</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 1: Empfohlene Anzahl von Würmern und Puffervolumen bei der Vorbereitung von Objektträgern.
Ergänzende Abbildung 1: Arbeitsabläufe bei der Anwendung einer Einzelbildquantifizierung mit MitoMAPR und der Stapelverarbeitung für mehrere Bilder. (A) Arbeitsablauf zur Quantifizierung der mitochondrialen Morphologie aus einem einzigen Bild mit Hilfe des MitoMAPR-Makros. (B) Z-Projektion einer rohen 3D-Bilddatei mit Fidschi (Max-Projektion). (C) Zuschneiden des interessierenden Bereichs aus dem projizierten Z-Bild. (D) Skelettbilder, die mit dem MitoMAPR-Makro aufgenommen wurden. Maßstabsleisten: 5 μm. (E) Arbeitsablauf zur Quantifizierung der mitochondrialen Morphologie aus mehreren Bildern mittels Batch-Verfahren unter Verwendung des MitoMAPR-Makros. (F) Screenshot des Zuschneidemakros. (G) Screenshot eines Batch-Prozesses für die Z-Projektion. (H) Screenshot des Auswahlbestätigungsfensters des Batch-Cropping-Makros. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Tabelle 1: Quantitative Analyse der mitochondrialen Morphologiemetriken im Muskelgewebe von C. elegans . Zu den aufgezeichneten Metriken gehören Objekte, Netzwerke, Kreuzungen pro Netzwerk, Verbindungspunkte, Objektlänge, mitochondrialer Fußabdruck, Objektfläche und mitochondriale Abdeckung, gemessen über verschiedene Tage. Die Daten bilden eine Grundlage für die Beurteilung von Veränderungen der mitochondrialen Morphologie mit zunehmendem Alter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/67610_Supplementary%20Table%201.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Tabelle 2: Auswirkungen immobilisierender Chemikalien auf die mitochondriale Morphologie bei C. elegans. Zu den Daten gehören Messungen wie Objekte, Netzwerke, Übergänge pro Netzwerk, Verbindungspunkte, Objektlänge, mitochondrialer Fußabdruck, Objektfläche und mitochondriale Abdeckung über unterschiedliche Konzentrationen und Zeitpunkte nach Probenvorbereitung mit M9-Puffer oder unterschiedlichen Konzentrationen von Tetramisol und Natriumazid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/67610_Supplementary%20Table%202.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Bildgebung und Quantifizierung der mitochondrialen Morphologie bei C. elegans während des Alterns

Mitochondria, important cellular organelles found in most eukaryotic cells, are major sites of energy production through aerobic respiration. Beyond this ...

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

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