Bildgebung und Quantifizierung der mitochondrialen Morphologie bei C. elegans während des Alterns
17. Januar 2025
Dieses Protokoll bietet einen standardisierten Ansatz für die Abbildung der mitochondrialen Morphologie in mehreren Geweben von C. elegans während des Alterns.
Dieses Protokoll bietet einen standardisierten Ansatz zur Abbildung und Quantifizierung der Veränderungen der mitochondrialen Morphologie in mehreren Geweben. Bei C elegance wird die mitochondriale Morphologie oft mit seiner Funktionalität in Verbindung gebracht. Veränderungen in der mitochondrialen Morphologie können unter verschiedenen Krankheitsbedingungen und mit dem Fortschreiten des Alterns beobachtet werden, die oft mit einer Dysregulation der mitochondrialen Funktion, verschiedenen Geweben und Eleganz korrelieren.
Weisen einzigartige mitochondriale Strukturen auf, die unterschiedliche Bildgebungsstrategien erfordern. Daher ist die Auswahl eines geeigneten Mikroskops und die Optimierung der Probenvorbereitung für eine erfolgreiche gewebespezifische Bildgebung von Mitochondrien und C Elegance unerlässlich. Hier haben wir uns entschieden, die transgenen Cele-Stämme zu verwenden, die mitochondrienlokalisiertes GFP exprimieren, anstelle von herkömmlichen mitochondrialen Farbstoffen.
Dies ermöglicht es uns, Off-Target-Effekte, onale Bi-Penetranz und die komplexen Probenvorbereitungsschritte zu vermeiden, die erforderlich sind, um Mitochondrien in verschiedenen Geweben mit einem Farbstoff sichtbar zu machen. Der Schwerpunkt unseres Labors liegt auf der Untersuchung der mitochondrialen Homöostase während Stress und Alterung. Die Standardisierung eines mitochondrialen Bildgebungsprotokolls ist unerlässlich, um extramentale Fehler zu minimieren und reproduzierbare Ergebnisse bezüglich Veränderungen der mitochondrialen Morphologie unter verschiedenen biologischen Bedingungen zu erzielen.
Besorgen Sie sich zunächst saubere Objektträger. Zur Probenvorbereitung geben Sie 10 bis 20 Mikroliter M neun Lösung auf den Objektträger und geben die gewünschte Anzahl adulter Würmer in einem bestimmten Alter in die Lösung. Decken Sie auf dem Objektträger die Würmer in der Lösung M neun mit einem Deckglas ab, um den Muskel abzubilden.
Mitochondrien, schieben Sie den Deckschirm an, um die Würmer zu rollen. Versiegeln Sie dann mit einem Nagellack die Seiten des Deckglases, um das Verdampfen der M nine Lösung zu verhindern. Verwenden Sie ein Standard-Weitfeldmikroskop, um Muskel- und epidermale Mitochondrien abzubilden, die die fluoreszierenden Markierungen exprimieren.
Verwenden Sie ein konfokales Mikroskop für die Darstellung der Darmmitochondrien und optimieren Sie die Bildgebungseinstellungen, um sie an den spezifischen Versuchsaufbau anzupassen. Um die Analyse zu starten, öffnen Sie nach der Installation die Anwendung Fiji, um das mimo mapper-Makro herunterzuladen und zu installieren. Laden Sie zunächst den Quellcode herunter.
Kopieren Sie den Code, der unter Ein IJM-Code für MIT-Mapper 1.0 aufgeführt ist. Öffnen Sie Fiji und gehen Sie zu Plugins, gefolgt von Neu und Makro Fügen Sie den kopierten Code in das Makrofenster ein. Speichern Sie dann das Makro für die zukünftige Verwendung per Datei und speichern Sie es unter.
Navigieren Sie zur Datei und öffnen Sie dann zum Öffnen eines mikroskopischen 3D-Bildes mit Zs.In Fidschi, erstellen Sie eine maximale Projektion unter dem Bild, gefolgt von Stapeln und Z-Projekt. Wählen Sie den Bereich der Slices in fokussierten Bildern für die maximale Projektion aus, und wählen Sie maximale Intensität als Projektionstyp aus, um das maximal projizierte Bild zu speichern. Gehen Sie als TIFF zu Datei und klicken Sie auf Speichern unter, gefolgt von tiff.
Klicken Sie auf Ausführen. Wenn Sie dazu aufgefordert werden, wählen Sie den Ordner aus, der die im vorherigen Schritt gespeicherte TIFF-Datei enthält. Wenn Sie aufgefordert werden, einen Bereich auszuwählen, erstellen Sie mit dem Rechteckwerkzeug ein Rechteck im Bild und drücken Sie zur Bestätigung auf OK.
Gehen Sie abschließend zur Datei und speichern Sie die Daten mit allen Werten, die sich auf die mitochondriale Morphologie beziehen, als Punkt-CSV-Datei. Die mitochondriale Morphologie war gewebespezifisch mit röhrenförmigen Mitochondrien, die sich an den Muskelfasern in den Muskeln ausrichteten, miteinander verbundenen netzartigen Strukturen im Darm und eher abgerundet oder oval waren. Die Bildgebung der Mitochondrien in der Hypodermis mit einem konfokalen Mikroskop verbesserte die Visualisierung der Darmmitochondrien, indem das unscharfe Licht im Vergleich zur Verbindungsmikroskopie reduziert wurde.
Auf den Objektträgern zeigten die Mitochondrien nach 30 Minuten im M neun-Puffer eine Fragmentierung, wobei die epidermalen Mitochondrien die ausgeprägteste Fragmentierung zeigten. Das Altern führte zu einer mitochondrialen Fragmentierung in allen Geweben, die als verkürzte und kugelförmige Strukturen erscheinen. Die Quantifizierung des MIT-Mappers zeigte, dass sich die Objektlänge in den Muskeln und der Verbindungspunkt in der Hypodermis änderten.
Überblick
Dieses Protokoll etabliert eine standardisierte Methode zur Bildgebung und Quantifizierung der mitochondrialen Morphologie in C. elegans in verschiedenen Geweben während des Alterungsprozesses. Die Studie hebt die Beziehung zwischen mitochondrialer Struktur und Funktionalität hervor und zeigt auf, wie sich Veränderungen in der Morphologie als Reaktion auf Alterung und Krankheit ergeben.
Wichtige Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Mitochondriale Morphologie
- Alterung
- C. elegans als Modellorganismus
Hintergrund
- Die mitochondriale Morphologie ist entscheidend für ihre Funktion.
- Veränderungen können auf Krankheitszustände und Alterungsfortschritt hindeuten.
- Verschiedene Gewebe in C. elegans zeigen einzigartige Anforderungen für die Bildgebung.
Verwendete Methoden
- Fluoreszente Bildgebung unter Verwendung von transgenem C. elegans, das mitochondrial-lokalisiertes GFP exprimiert.
- C. elegans
- Breitfeld- und Konfokalmikroskopie für gewebespezifische Bildgebung.
Hauptergebnisse
- Gewebespezifische mitochondriale Morphologien wurden dokumentiert.
- Alterung führte zu beobachtbarer Fragmentierung in allen Geweben.
- Quantitative Analyse offenbarte signifikante Veränderungen in der mitochondrialen Struktur.
Schlussfolgerungen
- Die Studie demonstriert eine zuverlässige Methode zur Beurteilung mitochondrialer Veränderungen in C. elegans.
- Das Verständnis dieser Dynamiken könnte die Forschung zu Alterung und mitochondrialer Dysfunktion vorantreiben.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Quantitative imaging of mitochondrial morphology in C. elegans enables high-confidence assessment of organelle dynamics during aging, supporting early discovery and mechanistic de-risking in metabolic and age-related disease research. Standardized protocols and robust quantification reduce variability, enhancing predictive confidence for target validation and translational continuity. This approach strengthens portfolio decisions by providing reproducible, tissue-specific mitochondrial phenotyping across the discovery pipeline.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of mitochondrial structural changes linked to functional decline during aging.
- Supports biological de-risking by distinguishing tissue-specific mitochondrial phenotypes.
- Facilitates predictive confidence in target selection for metabolic and aging-related pathways.
Screening & Assay Development
- Provides validated, reproducible imaging protocols for downstream phenotypic screening.
- Standardizes quantification of mitochondrial morphology using single-copy GFP constructs and mitoMAPR analysis.
- Enables reliable comparison of compound or genetic perturbations on mitochondrial structure.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mitochondrial phenotypes in C. elegans with disease-relevant cellular changes observed in higher organisms.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling cross-tissue and cross-age comparisons.
- Reduces translational risk by providing quantitative, tissue-specific readouts of mitochondrial health.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical model validation, supporting robust mitochondrial phenotyping at each stage.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven assessment of mitochondrial dynamics and pathway clarification during aging.
- Screening: Delivers standardized, quantitative outputs for assay readiness and reproducibility.
- Analytics: Provides objective morphological measurements and CSV data for statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Facilitates alignment of mitochondrial biomarkers between C. elegans and mammalian systems when supported by data.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable imaging and analysis workflow adaptable to diverse tissues and experimental conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in mitochondrial research.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized imaging and analysis protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by minimizing experimental variability.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets and models based on robust mitochondrial phenotyping.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microscopy, transgenic C. elegans handling, and image analysis.
- Needs access to wide field and confocal microscopes, as well as Fiji software with mitoMAPR macro.
- Demands cross-team standardization of imaging parameters and sample preparation.
- Adaptable to multiple tissues but may require optimization for specific experimental setups.
- Potential limitations include tissue-specific imaging challenges and time-dependent morphological changes ex vivo.
