Name: Zeitraffer-Epifluoreszenzmikroskopie: Bildgebung von Pseudomonas aeruginosa und Staphylococcus aureus : Heterogene Phänotypen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Erfahren Sie, wie Zeitraffer-Epifluoreszenzmikroskopie heterogene Phänotypen von Pseudomonas aeruginosa und Staphylococcus aureus sichtbar macht. Diese Methode erlaubt die Beobachtung von Persistern bei Antibiotikabehandlung.

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<meta charset="utf8"></head><body>Visualisierung der Antibiotika-Persistenz in bakteriellen Krankheitserregern

<ol><li>Brauner, A., Fridman, O., Gefen, O., Balaban, N. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinguishing+between+resistance%2C+tolerance+and+persistence+to+antibiotic+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Distinguishing between resistance, tolerance and persistence to antibiotic treatment.</a> Nat Rev Microbiol. 14, 320-330 (2016).</li>
<li>Balaban, N. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definitions+and+guidelines+for+research+on+antibiotic+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Definitions and guidelines for research on antibiotic persistence.</a> Nat Rev Microbiol. 17 (7), 441-448 (2019).</li>
<li>Conlon, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+chronic+and+relapsing+infections%3A+evidence+of+a+role+for+persister+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus chronic and relapsing infections: evidence of a role for persister cells.</a> Bioessays. 36 (10), 991-996 (2014).</li>
<li>Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+Pseudomonas+aeruginosa+strains+producing+high+levels+of+persister+cells+in+patients+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Emergence of Pseudomonas aeruginosa strains producing high levels of persister cells in patients with cystic fibrosis.</a> J Bacteriol. 192 (23), 6191-6199 (2010).</li>
<li>Verstraete, L., Van den Bergh, B., Verstraeten, N., Michiels, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecology+and+evolution+of+antibiotic+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Ecology and evolution of antibiotic persistence.</a> Trends Microbiol. 30 (5), 466-479 (2021).</li>
<li>Sett, A., Dubey, V., Bhowmik, S., Pathania, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+bacterial+persistence%3A+Mechanisms+and+strategies+for+effective+eradication%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Decoding bacterial persistence: Mechanisms and strategies for effective eradication.</a> ACS Infect Dis. 10 (8), 2525-2539 (2024).</li>
<li>Mempin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+extracellular+ATP+by+bacteria+during+growth%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Release of extracellular ATP by bacteria during growth.</a> BMC Microbiol. 13, 301(2013).</li>
<li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persister+cells%2C+dormancy+and+infectious+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Persister cells, dormancy and infectious disease.</a> Nat Rev Microbiol. 5 (1), 48-56 (2006).</li>
<li>Fauvart, M., De Groote, V. N., Michiels, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+persister+cells+in+chronic+infections%3A+clinical+relevance+and+perspectives+on+anti-persister+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Role of persister cells in chronic infections: clinical relevance and perspectives on anti-persister therapies.</a> J Med Microbiol. 60 (pt 6), 699-709 (2011).</li>
<li>Van den Bergh, B., Fauvart, M., Michiels, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation%2C+physiology%2C+ecology%2C+evolution+and+clinical+importance+of+bacterial+persisters%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Formation, physiology, ecology, evolution and clinical importance of bacterial persisters.</a> FEMS Microbiol Rev. 41, 219-251 (2017).</li>
<li>Levin, B. R., Rozen, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-inherited+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Non-inherited antibiotic resistance.</a> Nat Rev Microbiol. 4 (7), 556-562 (2006).</li>
<li>Davis, K. M., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+heterogeneity+within+bacterial+populations+via+single+cell+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Defining heterogeneity within bacterial populations via single cell approaches.</a> Bioessays. 38 (8), 782-790 (2016).</li>
<li>Hare, P. J., LaGree, T. J., Byrd, B. A., DeMarco, A. M., Mok, W. W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+technologies+to+study+phenotypic+heterogeneity+and+bacterial+persisters%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Single-cell technologies to study phenotypic heterogeneity and bacterial persisters.</a> Microorganisms. 9 (11), 2277(2021).</li>
<li>de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+of+Bacillus+subtilis+and+Streptococcus+pneumoniae+using+automated+time-lapse+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using automated time-lapse microscopy.</a> J Vis Exp. 53, e3145(2011).</li>
<li>Hare, P. J., Gonzalez, J. R., Quelle, R. M., Wu, Y. I., Mok, W. W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+and+transcriptional+activities+underlie+stationary-phase+Pseudomonas+aeruginosa+sensitivity+to+levofloxacin%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Spectr%22%5BJournal%5D)">Metabolic and transcriptional activities underlie stationary-phase Pseudomonas aeruginosa sensitivity to levofloxacin.</a> Microbiol Spectr. 12 (1), e0356723(2024).</li>
<li>Young, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+single-cell+gene+expression+dynamics+in+bacteria+using+fluorescence+time-lapse+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy.</a> Nat Protoc. 7 (1), 80-88 (2011).</li>
<li>Pang, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((agr-Dependent+interactions+of+Staphylococcus+aureus+USA300+with+human+polymorphonuclear+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J+Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">agr-Dependent interactions of Staphylococcus aureus USA300 with human polymorphonuclear neutrophils.</a> J Innate Immun. 2 (6), 546-559 (2010).</li>
<li>Bose, J. L., Fey, P. D., Bayles, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+tools+to+enhance+the+study+of+gene+function+and+regulation+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genetic tools to enhance the study of gene function and regulation in Staphylococcus aureus.</a> Appl Environ Microbiol. 79 (7), 2218(2013).</li>
<li>Schenk, S., Laddaga, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+method+for+electroporation+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Improved method for electroporation of Staphylococcus aureus.</a> FEMS Microbiol Lett. 73, 133-138 (1992).</li>
<li>Grosser, M. R., Richardson, A. R. Method for Preparation and Electroporation of S. aureus and S. epidermidis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGrosser%2C+MR+%22The+Genetic+Manipulation+of+Staphylococci.+Methods+Molecular+Biology%22">The Genetic Manipulation of Staphylococci. Methods Molecular Biology</a>. , Humana Press. New York, NY. (2016).</li>
<li>Krausz, K. L., Bose, J. L. Bacteriophage Transduction in Staphylococcus aureus: Broth-Based Method. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKrausz%2C+KL+%22The+Genetic+Manipulation+of+Staphylococci.+Methods+Molecular+Biology%22">The Genetic Manipulation of Staphylococci. Methods Molecular Biology</a>. , Humana Press. New York, NY. (2016).</li>
<li>Olson, M. E. Bacteriophage Transduction in Staphylococcus aureus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOlson%2C+ME+%22The+Genetic+Manipulation+of+Staphylococci.+Methods+Molecular+Biology%22">The Genetic Manipulation of Staphylococci. Methods Molecular Biology</a>. , Humana Press. New York, NY. (2016).</li>
<li>Fey, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+resource+for+rapid+and+comprehensive+phenotype+screening+of+nonessential+Staphylococcus+aureus+genes%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">A genetic resource for rapid and comprehensive phenotype screening of nonessential Staphylococcus aureus genes.</a> mBio. 4 (1), e00537-e00612 (2013).</li>
<li>Coe, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-strain+Tn-Seq+reveals+common+daptomycin+resistance+determinants+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Multi-strain Tn-Seq reveals common daptomycin resistance determinants in Staphylococcus aureus.</a> PLoS Pathog. 15 (11), e1007862(2019).</li>
<li>Figurski, D. H., Helinski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+an+origin-containing+derivative+of+plasmid+RK2+dependent+on+a+plasmid+function+provided+in+trans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Replication of an origin-containing derivative of plasmid RK2 dependent on a plasmid function provided in trans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (4), 1648(1979).</li>
<li>Shee, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+proteins+detect+spontaneous+DNA+breakage+in+human+and+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Engineered proteins detect spontaneous DNA breakage in human and bacterial cells.</a> eLife. 2, e01222(2013).</li>
<li>Kowalska-Krochmal, B., Dudek-Wicher, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+minimum+inhibitory+concentration+of+antibiotics%3A+methods%2C+interpretation%2C+clinical+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">The minimum inhibitory concentration of antibiotics: methods, interpretation, clinical relevance.</a> Pathogens. 10 (2), 165(2021).</li>
<li>Robinson, J. L., Jaslove, J. M., Murawski, A. M., Fazen, C. H., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+network+analysis+reveals+that+nitric+oxide+reductase+prevents+metabolic+cycling+of+nitric+oxide+by+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Metab+Eng%22%5BJournal%5D)">An integrated network analysis reveals that nitric oxide reductase prevents metabolic cycling of nitric oxide by Pseudomonas aeruginosa.</a> Metab Eng. 41, 67-81 (2017).</li>
<li>Wolff, J. A., MacGregor, C. H., Eisenberg, R. C., Phibbs, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+catabolite+repression+control+mutants+of+Pseudomonas+aeruginosa+PAO%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of catabolite repression control mutants of Pseudomonas aeruginosa PAO.</a> J Bacteriol. 173 (15), 4700-4706 (1991).</li>
<li>Batchelder, J. I., Taylor, A. J., Mok, W. W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolites+augment+oxidative+stress+to+sensitize+antibiotic-tolerant+Staphylococcus+aureus+to+fluoroquinolones%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Metabolites augment oxidative stress to sensitize antibiotic-tolerant Staphylococcus aureus to fluoroquinolones.</a> mBio. , e0271424(2024).</li>
<li>Power, A. D., Mok, W. W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agar+and+agarose+used+for+Staphylococcus+aureus+biofilm+cultivation+impact+fluoroquinolone+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Agar and agarose used for Staphylococcus aureus biofilm cultivation impact fluoroquinolone tolerance.</a> J Appl Microbiol. 135 (8), lxae191(2024).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Peng, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+BaSiC+tool+for+background+and+shading+correction+of+optical+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A BaSiC tool for background and shading correction of optical microscopy images.</a> Nat Commun. 8, 14836(2017).</li>
<li>Ducret, A., Quardokus, E., Brun, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicrobeJ%2C+a+tool+for+high+throughput+bacterial+cell+detection+and+quantitative+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Microbiol%22%5BJournal%5D)">MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis.</a> Nat Microbiol. 1 (7), 16077(2016).</li>
<li>Paintdakhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oufti%3A+an+integrated+software+package+for+high-accuracy%2C+high-throughput+quantitative+microscopy+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Oufti: an integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis.</a> Mol Microbiol. 99 (4), 767-777 (2016).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+growth+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Robust growth of Escherichia coli.</a> Curr Biol. 20 (12), 1099-1103 (2010).</li>
<li>Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+single-cell+chemostat%3A+an+agarose-based%2C+microfluidic+device+for+high-throughput%2C+single-cell+studies+of+bacteria+and+bacterial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities.</a> Lab Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>BaSiC</td><td>GitHub</td><td>https://github.com/marrlab/BaSiC</td><td></td></tr><tr><td>Certified Molecular Biology Agarose</td><td>Biorad</td><td>1613101</td><td></td></tr><tr><td>Fiji-ImageJ</td><td>NIH</td><td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td><td></td></tr><tr><td>Austauschbare Deckglasschale</td><td>Bioptechs</td><td>190310-35</td><td>35 mm ICD zur Vorbereitung von Agarose-Pads; kommt mit 30 mm (#1,5) Deckgläsern</td></tr><tr><td>Lumencor Spectra 7 LED Light Engine</td><td>Lumencor</td><td>https://lumencor.com/products/spectra-light-engine</td><td>Spectra 7 LED Light</td></tr><tr><td>Engine MetaMorph</td><td>Molecular Devices</td><td>Premier Version 7.10.5</td><td></td></tr><tr><td>pco.edge 4.2 bi sCMOS Kamera</td><td>Excelitas</td><td>https://www.excelitas.com/product/pcoedge-42-bi-usb-scmos-camera</td><td>sCMOS Kamera</td></tr><tr><td>PeCon Inkubationskammer für lebende Zellen</td><td>peCon</td><td>https://www.pecon.biz/</td><td></td></tr> <tr><td>Thomas Scientific Rundes Deckglas, #1,5 Stärke, 25 mm, 100er Pack</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1272770</td><td>25 mm (#1,5) Deckgläser</td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert 200M Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/widefield-microscopes/axiovert-for-materials.html</td><td>Inverses Mikroskop mit Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil Ph3 M27 Objektiv, Lumencor Spectra 7 LED Light Engine und pco.edge 4.2 bi sCMOS Kamera (6,5 mm Pixelgröße)</td></tr></tbody></table>

zeitraffer-epifluoreszenzmikroskopie: bildgebung von pseudomonas aeruginosa und staphylococcus aureus : heterogene phänotypen

Time-Lapse Epifluorescence Microscopy Imaging of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Heterogeneous Phenotypes

Die erfolgreiche Einführung von Reporterplasmiden in P. aeruginosa und S. aureus wird durch das Wachstum mit den richtigen selektiven Antibiotika angezeigt und kann durch Kolonie-PCR und/oder Sequenzierung bestätigt werden. Die modifizierten Stämme sollten als phänotypische Reporter verifiziert werden, indem sie Bedingungen ausgesetzt werden, von denen bekannt ist, dass das interessierende Gen induziert wird, und die resultierende Fluoreszenz kann durch Durchflusszytometrie, Spektrophotometrie oder Epifluoreszenzmikroskopie gemessen werden (Abbildung 1).
Um die Auswahl einer oder mehrerer Antibiotikadosen zu erleichtern, die für nachfolgende Experimente verwendet werden, führen Sie konzentrationsabhängige Antibiotika-Persister-Assays für die interessierenden P . aeruginosa - oder S. aureus-Stämme durch. Konzentrationsabhängige Assays führen in der Regel zu einer biphasischen Kurve mit einer steilen anfänglichen Steigung bei niedrigeren Antibiotikakonzentrationen und einer plateauartigen oder weniger steilen Steigung bei höheren Konzentrationen. Bei einigen Antibiotika-Spezies-Paaren kann es jedoch nicht zu einer eindeutigen biphasischen Kurve kommen. Zum Beispiel ist die Kurve für S. aureus dElafloxacin-Kurve eindeutig zweiphasig (Abbildung 3A), aber die P . aeruginosa Levofloxacin-Kurve ist es nicht (Abbildung 3B)15. In diesem Szenario würden wir eine Konzentration wählen, die mindestens das 10-fache der MHK beträgt (z. B. 5 μg/ml, was etwa dem 15-fachen der MHK für P. aeruginosa entspricht)15. Da jedoch eine 15-fache Levofloxacin-MHK nur zu ~0,001 % P . aeruginosa-Überlebenden führt, verwenden wir eine Behandlung mit 1 μg/ml Levofloxacin, wenn wir bei der Bildgebung von Zellen Persister sehen möchten, wie sie sich auf antibiotikafreien Agarose-Pads erholen (Ergänzendes Video 6); Andernfalls wird die Anzahl der Sichtfelder, die zum Abbilden mehrerer Persister erforderlich sind, unerschwinglich.
Zu Beginn der Bildgebung sollte die ideale Proben- und Agarose-Pad-Vorbereitung über das gesamte Sichtfeld planar erscheinen, frei von großen Ablagerungen, Falten oder Luftblasen und mit gleichmäßig verteilten Einzelzellen. Um gut verteilte Einzelzellen zu erhalten, kann eine Optimierung der Probenverdünnung oder -resuspension erforderlich sein. Bei S. aureus neigen die Zellen dazu, kleine Cluster zu bilden und müssen gründlich vortexiert werden, bevor sie auf das Agarosepad ausgesät werden (Abbildung 4 und Abbildung 5). Bei P. aeruginosa können Zellen Aggregate bilden, die in einer klebrigen extrazellulären Matrix in Suspension eingeschlossen sind; Es ist notwendig, diese Proben gründlich zu pipettieren und die Aggregate für die Bildgebung einzelner Zellen aufzubrechen. 
Nach Abschluss eines bildgebenden Experiments erscheint ein erfolgreicher Zeitraffer von Bildern im Fokus, stabil beleuchtet und mit minimaler Drift in der x-y-Ebene während des gesamten Experiments. Ergänzendes Video 7 stellt eine optimale Bildaufnahme dar: t ist der Phasenkanal von Ergänzendes Video 4 vor der Schatten- oder Driftkorrektur. Ein Fokusverlust kann auftreten, wenn sich durch Kondensation (durch Überfeuchtung oder unzureichende Probenerwärmung) Wassertropfen auf dem oberen 25-mm-Deckglas bilden, die das Licht verzerren und die Fokusebene außerhalb des maximalen Suchbereichs des Autofokus-Algorithmus verschieben (Ergänzendes Video 8). Schwankungen in der Beleuchtung deuten in der Regel auf ein unzureichendes Immersionsöl zum Zeitpunkt der Bildgebung hin. Wenn sich der Tisch zu schnell bewegt, kann es sein, dass das Öl auf dem Objektiv hinterherschleift und bei der Aufnahme der Bilder immer noch aufholt. Dies kann abgemildert werden, indem Sie die Aufnahmesteuerung so anpassen, dass die Bewegungsgeschwindigkeit verlangsamt wird, oder indem Sie eine Pause zwischen der Bewegung zur nächsten Position und der Bildaufnahme hinzufügen. Eine größere Probendrift sieht so aus, als würden viele Zellen über das Sichtfeld streifen, während andere an Ort und Stelle bleiben (Ergänzendes Video 9). Dies tritt in der Regel später in Experimenten auf, da das Agarose-Pad aufgrund unzureichender Feuchtigkeitskontrolle dehydriert ist. Die in dieser Arbeit vorgestellte Agarose-Pad-Vorbereitung wurde entwickelt, um die Probenstabilität zu verbessern, aber eine ordnungsgemäße Erwärmung/Befeuchtung der Probe und ihrer Umgebung ist für eine optimale Bildaufnahme erforderlich.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67617/67617fig1.jpg"> 
Abbildung 1: Fluoreszierende Reporterstämme beleuchten die Expression eines Gens von Interesse. (A) S. aureus wurde mit einem GFP-Transkriptionsreporter für ein Gen von Interesse gemäß Protokoll 1 transduziert. Der Reporterstamm wurde 24 Stunden lang mit einem Antibiotikum behandelt, mit PBS gewaschen und dann auf ein Agarosepad aus CA-MHB plus Propidiumiodid (1,6 μM) und Chloramphenicol (10 μg/ml zur Aufrechterhaltung des Reporterplasmids) zur Bildgebung während der Genesung ausgesät (Ergänzendes Video 1). (B) P. aeruginosa wurde mit einem Plasmid transformiert, das einen mScarlet-verknüpften translationalen Reporter für ein Protein von Interessetrug 26. Der Reporterstamm wurde 5 Stunden lang mit einem Antibiotikum behandelt, mit PBS gewaschen und dann auf ein Agarose-Pad aus BSM plus Tet (75 μg/ml; zur Erhaltung des Reporterplasmids) zur Bildgebung während der Genesung ausgesät (Ergänzendes Video 2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/67617fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67617/67617fig2.jpg"> 
Abbildung 2: Vermehrung und Ernte von Bakteriophagen. (A) Die sechs Tafeln zeigen sechs verschiedene Mengen an verdünntem Phagenbestand auf den Rasenflächen von S. aureus RN4220. Die roten Umrisse zeigen die drei Platten, die geerntet werden würden, von der Platte mit der größten Klarheit (fette rote Umrandung; 1 x109 PFU/ml) bis zu den nächsten beiden Verdünnungen (1 x108 und 1 x 107 PFU/ml). Die schwarzen Pfeile zeigen auf einzelne Tafeln. (B) Um Phagen aus den Platten zu ernten, kratzen Sie die weiche Agarschicht (links) ab, übertragen Sie die Aufschlämmung auf die nächste Verdünnungsplatte (Mitte) und kombinieren Sie sie, nachdem Sie den weichen Agar von allen drei Platten zusammengepoolt haben, zu einem konischen Röhrchen für die Zentrifugation (rechts). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/67617fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67617/67617fig3.jpg"> 
Abbildung 3: Repräsentative konzentrationsabhängige Persister-Assays. Die konzentrationsabhängige Fluorchinolon-Persistenz wurde in stationärer Phase (A) S. aureus (gegen Delafloxacin) und (B) P. aeruginosa (gegen Levofloxacin) untersucht. Nachfolgende Experimente verwenden 5 μg/ml Delafloxacin (roter Kreis), da die Tötung von S. aureus bei dieser Konzentration ein Plateau erreicht hatte. Eine Dosierung von mindestens 1 μg/ml Levofloxacin (roter Kreis) würde für nachfolgende Experimente mit P. aeruginosa verwendet werden. Beachten Sie, dass die bakterielle Abtötung für P. aeruginosa kein Plateau erreicht, aber es gibt immer noch eine weniger steile "zweite Phase" der biphasischen Kurve, die auf eine persistente Subpopulation hinweist. Panel 3B wurde mit Genehmigung von Hare et al.15 adaptiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/67617fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67617/67617fig4.jpg"> 
Abbildung 4: Bildgebung bakterieller Phänotypen während der Antibiotikabehandlung. Stationäre (A) S. aureus - und (B) P. aeruginosa-Zellen wurden auf Agarose-Pads, die Fluorchinolon-Antibiotika enthielten, ausgesät und während der Behandlung überwacht: 5 μg/ml Delafloxacin für S. aureus (Ergänzendes Video 3) und 5 μg/ml Levofloxacin für P. aeruginosa (Ergänzendes Video 4)15. Propidiumiodid (PI; 16 μM für P. aeruginosa, 1,6 μM für S. aureus) wurde den Pads zugesetzt, um tote oder sterbende Zellen zu markieren. S. aureus-Zellen bleiben in Gegenwart des FQ weitgehend intakt und am Leben, während die meisten P. aeruginosa-Zellen drastische morphologische Veränderungen durchlaufen, einschließlich der Bildung runder Sphäroplasten, bevor sie lysieren und absterben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/67617fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67617/67617fig5.jpg"> 
Abbildung 5: Verfolgung von Persistern während der Erholung. (A) S. aureus - und (B) P. aeruginosa-Populationen wurden auf Agarose-Pads mit frischem Medium ausgesät, nachdem sie mit Fluorchinolonen (5 μg/ml Delafloxacin für S. aureus und 1 μg/ml Levofloxacin für P. aeruginosa) behandelt und während ihrer Genesung nach der Behandlung überwacht worden waren (Ergänzendes Video 5 und Ergänzendes Video 6). Die Perisisters sind in den ersten beiden Bildern in jedem Panel mit grünen Pfeilen gekennzeichnet und blieben während der Antibiotikabehandlung intakt und lebensfähig. Nach einer anfänglichen Verzögerungsphase begannen sich die Persister zu teilen und brachten neue Nachkommen hervor (gekennzeichnet durch grüne Kreise). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/67617fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67617/67617fig6.jpg"> 
Abbildung 6: Probenvorbereitung für das Mikroskop. (A) Schematische Darstellung des Arbeitsablaufs bei der Probenvorbereitung unter Verwendung einer austauschbaren Deckglasschale ("Kammer"). (B) Bild der zerlegten Kammer und ihrer einzelnen Komponenten. (C) Bild der vollständig zusammengebauten Kammer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/67617fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzendes Video 1: S. aureus Persister. Videodatei mit den Bildern in Abbildung 1A. Kurz gesagt, S. aureus , der einen GFP-Transkriptionsreporter für ein Gen von Interesse trug, wurde 24 Stunden lang mit einem Antibiotikum behandelt, mit PBS gewaschen und dann auf ein Agarose-Pad aus CA-MHB plus Propidiumiodid (1,6 μM) und Chloramphenicol (10 μg/ml) zur Bildgebung während der Genesung ausgesät. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS1_S-aureus_persister_video.avi" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.</a>
Ergänzendes Video 2: P. aeruginosa Persister. Videodatei mit Bildern in Abbildung 1B. Kurz gesagt, P. aeruginosa mit einem mScarlet-linked translationalen Reporter für ein Protein von Interesse wurde 5 Stunden lang mit einem Antibiotikum behandelt, mit PBS gewaschen und dann auf ein Agarose-Pad mit BSM plus Tet (75 μg/ml) ausgesät, um während der Genesung bildgebendzu machen 26. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS2_Paeru-fluorescent-persister.avi" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.</a>
Ergänzendes Video 3: S. aureus während der Antibiotikabehandlung. Eine stationäre Phasenkultur von S. aureus, die in reichhaltigen, chemisch definierten Medien gezüchtet wurde, wurde auf Agarose-Pads ausgesät, die aus den zellfreien konditionierten Medien der Kultur mit Propidiumiodid (1,6 μM) und Delafloxacin (5 μg/ml) hergestellt wurden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS3_S-aureus_treatment.avi" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.</a>
Ergänzendes Video 4: P. aeruginosa während der Antibiotikabehandlung. Eine stationäre Phasenkultur von P. aeruginosa , die in BSM gezüchtet wurde, wurde auf Agarose-Pads ausgesät, die aus zellfrei konditionierten Medien aus einer parallel in BSM gezüchteten Kultur von P. aeruginosa hergestellt wurden; Das Agarose-Pad enthielt auch Propidiumiodid (16 μM) und Levofloxacin (5 μg/ml). Dieses Video wurde mit Genehmigung von Hare et al.15 adaptiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS4_P-aeruginosa_treatment.avi" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.</a>
Ergänzendes Video 5: S. aureus während der Genesung nach Antibiotika. S. aureus wurde in reichhaltigen, chemisch definierten Medien in die stationäre Phase gezüchtet. Die stationären Phasenkulturen wurden 24 Stunden lang mit 5 μg/ml Delafloxacin in Reagenzgläsern behandelt, mit PBS gewaschen und dann für die Bildgebung auf antibiotikafreie CA-MHB-Agarose-Pads mit Propidiumiodid (1,6 μM) ausgesät. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS5_S-aureus_recovery.avi" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.</a>
Ergänzendes Video 6: P. aeruginosa während der postantibiotischen Erholung. Eine stationäre Phasenkultur von P. aeruginosa , die in BSM gezüchtet wurde, wurde 7 Stunden lang mit 1 μg/ml Levofloxacin in Reagenzgläsern behandelt, mit PBS gewaschen und dann zur Bildgebung auf antibiotikafreie BSM-Agarose-Pads mit Propidiumiodid (16 μM) ausgesät. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS6_P-aeruginosa_recovery.avi" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.</a>
Ergänzendes Video 7: Beispiel für eine optimale Bildaufnahme. Dieses Video ist der Phasenkanal von Supplementary Video 4 vor der Bildverarbeitung als Beispiel für eine optimale Zeitrafferaufnahme. Beachten Sie die minimale Drift, die stabile Beleuchtung und die Beibehaltung des Fokus während des gesamten Experiments. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS7_uncorrected-Paeru.avi" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.</a>
Ergänzendes Video 8: Beispiel für eine suboptimale Bildaufnahme durch Kondensation. Dieses Video zeigt einen Teil eines Experiments, bei dem die Bildaufnahme durch eine schlechte Schärfe beeinträchtigt wurde, wahrscheinlich aufgrund von Kondensation in der Kammer aufgrund unsachgemäßer Erwärmung der Probe und/oder Überbefeuchtung der Bildgebungsumgebung. Bei der abgebildeten Probe handelte es sich um mit Levofloxacin behandelte P. aeruginosa während der postantibiotischen Erholung auf einem BSM-Agarose-Pad. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS8_Suboptimal_Imaging_Condensation.avi" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.</a>
Ergänzendes Video 9: Beispiel für eine suboptimale Bildaufnahme aufgrund von Drift. Dieses Video zeigt einen Teil eines Experiments, bei dem die Bildaufnahme durch Probendrift beeinträchtigt wurde, wahrscheinlich aufgrund von Dehydrierung und dem Schrumpfen/Abheben des Agarose-Pads vom Deckglas. Bei der abgebildeten Probe handelte es sich um P. aeruginosa auf einem Agarose-Pad, das Levofloxacin und Propidiumiodid enthielt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS9_Suboptimal_Drift.avi" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.</a>
Ergänzende Datei 1: 25mm-3D-Teiler-für-35mmBioptechs.stl <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/25mm-3D-divider-for-35mmBioptechs.stl" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Zeitraffer-Epifluoreszenzmikroskopie: Bildgebung von Pseudomonas aeruginosa und Staphylococcus aureus : Heterogene Phänotypen

Antibiotic persistence is a phenomenon in which a small number of bacterial cells in a genetically susceptible population survive antibiotic treatment ...

time-lapse-epifluorescence-microscopy-imaging-pseudomonas-aeruginosa

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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