Zeitraffer-Epifluoreszenzmikroskopie: Bildgebung von Pseudomonas aeruginosa und Staphylococcus aureus : Heterogene Phänotypen

Die Forschung unseres Labors konzentriert sich auf die Frage, warum Antibiotika versagen. Insbesondere interessieren wir uns für die wenigen Zellen, die in den Bakterienpopulationen als Persister bezeichnet werden und angeblich durch das Antibiotikum abgetötet werden sollen, aber eine Antibiotikabehandlung überleben können. Und es wird angenommen, dass diese Persister dazu führen, dass Infektionen nach Beendigung der Antibiotikabehandlung wieder auftreten.

Wir sind also daran interessiert, die Genexpression und den Stoffwechsel dieser Persister zu untersuchen, um ihre Überlebensstrategien besser zu verstehen. Die aktuelle Herausforderung für das Persister-Feld besteht darin, den Durchsatz mit der Sensitivität einzelner Zellen in Einklang zu bringen. Wir müssen die Fähigkeit einer einzelnen Zelle, sich nach der Behandlung zu teilen, die sie als Persister qualifiziert, mit einem messbaren Phänotyp abgleichen, der uns helfen kann, das Innenleben der Zelle zu verstehen.

Und wir müssen dies möglicherweise für Tausende von Zellen tun, um auch nur einen einzigen Persister zu erfassen. Unser Protokoll wurde so entwickelt, dass es im Vergleich zu ungenauen Agar-Sandwich-Methoden oder der Herstellung von mikrofluidischen Geräten, die technisch anspruchsvoll sein können, einfach zu implementieren ist. Wir haben festgestellt, dass unser Protokoll eine reproduzierbare und stabile Bildgebung über die Zeit mit minimalem Materialaufwand ermöglicht, was bedeutet, dass es sowohl kostengünstig als auch minimaler Aufwand für die qualitativ hochwertige Datenerfassung ist.

Unsere zukünftige Forschung wird eine Kombination aus Omics und Einzelzellansätzen verwenden, um zu untersuchen, wie Krankheitserreger auf die Behandlung mit verschiedenen Klassen von Antibiotika ansprechen und sich davon erholen. Unser oberstes Ziel ist es, dieses Verständnis zu nutzen, um neuartige Strategien zur Verbesserung der Behandlung klinischer Infektionen zu entwickeln. Legen Sie zunächst einen sterilen 30-Millimeter-Deckglas in den Boden des Edelstahlbodens einer austauschbaren Deckschale.

Fädeln Sie den Polycarbonat-Einsatz vorsichtig in den Boden ein, stellen Sie sicher, dass der Deckschieber den Boden der Kammer bildet, und dichten Sie ihn durch Zusammendrücken des angebrachten Silikon-O-Rings ab. Platzieren Sie eine benutzerdefinierte 3D-gedruckte Trennwand auf dem 30 Millimeter dicken Deckglas, um eine Kreuzkontamination der Modalzellen zu verhindern. Bereiten Sie 1,5 % Agarose in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen mit dem Medium Ihrer Wahl zu und schwenken Sie es vorsichtig, um es zu mischen.

Lösen Sie die Kappe des konischen Rohrs und setzen Sie es in einen Glasbecher oder eine mikrowellengeeignete Halterung ein. Die Agarosemischung auf hoher Stufe in die Mikrowelle stellen und alle drei bis vier Sekunden anhalten, um zu schwenken und zu mischen, damit sie nicht übersprudelt. Prüfen Sie nach einer Minute, ob noch ungeschmolzene Agarose in der Mischung vorhanden ist.

Wenn sie gleichmäßig klar ist, lassen Sie die Agarose kurz auf etwa 60 Grad Celsius abkühlen. Fügen Sie die entsprechenden Antibiotika oder Matrizen hinzu und schwenken Sie sie vorsichtig, um die Blasenbildung zu vermeiden. Pipettieren Sie zwei Milliliter der Agarose in die Kammer mit dem 30-Millimeter-Deckglas.

Legen Sie vorsichtig einen sterilen 25 Millimeter Deckglas über die Agarose in der oberen Kammeröffnung. Lassen Sie das Pad ein bis zwei Stunden lang festigen. Wenn das Pad verfestigt ist, verwenden Sie einen Permanentmarker mit feiner Spitze, um die Positionen und Identitäten der einzelnen Proben auf dem 25-Millimeter-Deckglas zu markieren.

Drehen Sie die Kammer so um, dass der Grundring aus Edelstahl nach oben zeigt, und halten Sie den Polycarbonat-Einsatz vorsichtig darunter, während Sie den Boden ausfädeln. Legen Sie den Edelstahlsockel beiseite. Schieben Sie den 30-Millimeter-Deckblatt-Slip vom Agarose-Pad ab und entsorgen Sie ihn.

Verdünnen Sie die Zellkulturen von Pseudomonas aeruginosa oder Staphylococcus aureus in PBS auf eine geringe Dichte, die für die Visualisierung einzelner Zellen geeignet ist. Pipettieren Sie kräftig auf und ab, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen. Spotten Sie fünf Mikroliter der verdünnten Zellsuspensionen an den markierten Stellen auf dem Agarose-Pad.

Sobald die Flecken getrocknet sind, legen Sie einen neuen sterilen 30-Millimeter-Deckslip über das Pad. Halten Sie dann die Polycarbonat-Einlage mit einer Hand fest und fädeln Sie den Edelstahlboden langsam wieder über den Deckglas. Sobald die Kammer verschlossen ist, prüfen Sie, ob die Agarose die Oberfläche des 30-Millimeter-Deckglases berührt.

Drücken Sie mit dem stumpfen Ende einer Pinzette vorsichtig gegen den 25-Millimeter-Deckglas, bis die Agarose den 30-Millimeter-Deckglas gleichmäßig auf seiner Oberfläche berührt. Bereiten Sie zunächst die Umgebungssteuerungen des Mikroskops und der Bildgebungskammer vor, indem Sie die Temperaturen des Inkubators auf der Bühne und des Großkammer-Inkubators auf 37 Grad Celsius einstellen. Schalten Sie anschließend den Kammerbefeuchter ein.

Legen Sie ein Agarose-Pad-Präparat in den Inkubator auf der Bühne und schließen Sie die Kammer, um eine Äquilibrierung zu ermöglichen. Bereiten Sie die MetaMorph-Software für die Bildaufnahme vor, indem Sie den integrierten Autofokus-Algorithmus so konfigurieren, dass der Phasenkanal während der mehrdimensionalen Aufnahme verwendet wird. Legen Sie auf der Registerkarte "Bühne" mehrere Tischpositionen für jede Probe fest, wobei Sie auf Sichtfelder mit gleichmäßig verteilter Zelldichte abzielen.

Konfigurieren Sie dann auf der Registerkarte Zeitraffer die Dauer und Häufigkeit der Bildaufnahme. Stellen Sie auf der Registerkarte Wellenlängen die gewünschten Kanäle für die Erfassung ein und passen Sie die Belichtungszeiten basierend auf der Signalintensität der Probe an. Sobald sich das Agarose-Pad in der Kammer erwärmt hat, setzen Sie den Befeuchtungsdeckel auf den Inkubator auf der Bühne.

Wechseln Sie anschließend am Mikroskop vom Phasenkontrast in den differentiellen Interferenzkontrastmodus. Stellen Sie den Kondensor und die Aperturblende ein, um eine korrekte Kohler-Beleuchtung zu erzielen. Nachdem Sie die Einstellungen abgeschlossen haben, wechseln Sie wieder in den Phasenkontrastmodus.

Navigieren Sie zu jeder Tischposition, passen Sie den Fokus an und setzen Sie die Tischposition auf die neue Fokusebene zurück. Klicken Sie auf die Schaltfläche Erfassen, um die mehrdimensionale Erfassung zu starten. Um nach der Aufnahme Bilder zusammenzustellen, öffnen Sie MetaMorph und verwenden Sie die App "Multidimensionale Daten überprüfen", um die gewünschten Kanäle oder Wellenlängen auszuwählen und alle Zeitpunkte für jede Tischposition einzubeziehen.

Klicken Sie auf Bilder laden und speichern Sie jede Zusammenstellung mit dem entsprechenden Kanalnamen als TIFF-Datei. Es wurde eine Zeitrafferbildgebung von Staphylococcus aureus-Zellen durchgeführt, die eine Propidiumiodid-Färbung mit fortschreitender Antibiotikabehandlung zeigte, was auf eine Membranschädigung hindeutete. Die Bildgebung von Pseudomonas aeruginosa während der Antibiotikabehandlung zeigte Zellen, die eine Sphäroplastenbildung, Filamentierung und zytoplasmatische Kondensation durchlaufen, begleitet von einer Propidiumiodid-Färbung.

Die erfolgreiche Vorbereitung des Agarose-Pads und die Bildgebungsbedingungen ermöglichten die Beobachtung von Staphylococcus aureus, der sich von einer Antibiotikabehandlung erholte, und von Pseudomonas aeruginosa, der sich von einer Antibiotikabehandlung erholte, um große Cluster aus einzelnen Zellen zu bilden.