Name: Live-Bildgebung des synaptischen Vesikelrecyclings in der neuromuskulären Verbindung von sezierten Zebrafischlarven (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Erfahren Sie die Live-Bildgebung synaptischer Vesikelrecycling-Prozesse an der neuromuskulären Verbindung von sezierten Zebrafischlarven mit pHluorin-basierter Fluoreszenztechnik. Diese kosteneffiziente Methode ermöglicht die Untersuchung synaptischer Übertragung unter physiologischen und pathologischen Bedingungen.

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<ol><li>Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synaptic+vesicle+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The synaptic vesicle cycle.</a> Ann Rev Neurosci. 27, 509-547 (2004).</li>
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<li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+ph-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with ph-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+phluorins+for+optical+measurements+of+presynaptic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">The use of phluorins for optical measurements of presynaptic activity.</a> Biophys. J. 79 (4), 2199-2208 (2000).</li>
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<li>Egashira, Y., Takase, M., Takamori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+vacuolar-type+h%2B+atpase-mediated+proton+influx+into+synaptic+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Monitoring of vacuolar-type h+ atpase-mediated proton influx into synaptic vesicles.</a> J Neurosci. 35 (8), 3701-3710 (2015).</li>
<li>Egashira, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+ph+dynamics+in+gabaergic+synaptic+vesicles+illuminates+the+mechanism+and+kinetics+of+gaba+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Unique ph dynamics in gabaergic synaptic vesicles illuminates the mechanism and kinetics of gaba loading.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (38), 10702-10707 (2016).</li>
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<li>Kwon, S. E., Chapman, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptophysin+regulates+the+kinetics+of+synaptic+vesicle+endocytosis+in+central+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptophysin regulates the kinetics of synaptic vesicle endocytosis in central neurons.</a> Neuron. 70 (5), 847-854 (2011).</li>
<li>Voglmaier, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+endocytic+pathways+control+the+rate+and+extent+of+synaptic+vesicle+protein+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Distinct endocytic pathways control the rate and extent of synaptic vesicle protein recycling.</a> Neuron. 51 (1), 71-84 (2006).</li>
<li>Balaji, J., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-vesicle+imaging+reveals+that+synaptic+vesicle+exocytosis+and+endocytosis+are+coupled+by+a+single+stochastic+mode%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-vesicle imaging reveals that synaptic vesicle exocytosis and endocytosis are coupled by a single stochastic mode.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (51), 20576-20581 (2007).</li>
<li>Santos, M. S., Park, C. K., Foss, S. M., Li, H., Voglmaier, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorting+of+the+vesicular+gaba+transporter+to+functional+vesicle+pools+by+an+atypical+dileucine-like+motif%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sorting of the vesicular gaba transporter to functional vesicle pools by an atypical dileucine-like motif.</a> J Neurosci. 33 (26), 10634-10646 (2013).</li>
<li>Wen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronous+and+asynchronous+modes+of+synaptic+transmission+utilize+different+calcium+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Synchronous and asynchronous modes of synaptic transmission utilize different calcium sources.</a> Elife. 2, e01206(2013).</li>
<li>Wen, H., Hubbard, J. M., Wang, W. C., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatigue+in+rapsyn-deficient+zebrafish+reflects+defective+transmitter+release%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fatigue in rapsyn-deficient zebrafish reflects defective transmitter release.</a> J Neurosci. 36 (42), 10870-10882 (2016).</li>
<li>Wyatt, R. M., Balice-Gordon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+synaptic+vesicle+release+at+neuromuscular+synapses+of+mice+expressing+synaptophluorin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in synaptic vesicle release at neuromuscular synapses of mice expressing synaptophluorin.</a> J Neurosci. 28 (1), 325-335 (2008).</li>
<li>Tabares, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+synaptic+function+at+the+neuromuscular+junction+of+a+mouse+expressing+synaptophluorin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Monitoring synaptic function at the neuromuscular junction of a mouse expressing synaptophluorin.</a> J Neurosci. 27 (20), 5422-5430 (2007).</li>
<li>Odermatt, B., Nikolaev, A., Lagnado, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encoding+of+luminance+and+contrast+by+linear+and+nonlinear+synapses+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Encoding of luminance and contrast by linear and nonlinear synapses in the retina.</a> Neuron. 73 (4), 758-773 (2012).</li>
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<li>Vaithianathan, T., Henry, D., Akmentin, W., Matthews, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+dynamics+of+synaptic+vesicle+trafficking+and+fusion+at+the+presynaptic+active+zone%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Nanoscale dynamics of synaptic vesicle trafficking and fusion at the presynaptic active zone.</a> eLife. 5, e13245(2016).</li>
<li>Vaithianathan, T., Wollmuth, L. P., Henry, D., Zenisek, D., Matthews, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+newly+released+synaptic+vesicle+proteins+at+ribbon+active+zones%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Tracking newly released synaptic vesicle proteins at ribbon active zones.</a> iScience. 17, 10-23 (2019).</li>
<li>Shrestha, A. P., Vaithianathan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+dynamics+of+single+fused+synaptic+vesicle+proteins+from+a+single+ribbon+active+zone+in+zebrafish+retinal+bipolar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Tracking the dynamics of single fused synaptic vesicle proteins from a single ribbon active zone in zebrafish retinal bipolar cells.</a> STAR Protoc. 3 (1), 101107(2022).</li>
<li>Egashira, Y., Zempo, B., Sakata, S., Ono, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+neuromuscular+junction+research+prompted+by+the+zebrafish+model%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opinion+Physiol%22%5BJournal%5D)">Recent advances in neuromuscular junction research prompted by the zebrafish model.</a> Curr Opinion Physiol. 4, 70-75 (2018).</li>
<li>Egashira, Y., Kumade, A., Ojida, A., Ono, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneously+recycling+synaptic+vesicles+constitute+readily+releasable+vesicles+in+intact+neuromuscular+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spontaneously recycling synaptic vesicles constitute readily releasable vesicles in intact neuromuscular synapses.</a> J Neurosci. 42 (17), 3523-3536 (2022).</li>
<li>Weng, W., Li, D., Peng, C., Behnisch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recording+synaptic+plasticity+in+acute+hippocampal+slices+maintained+in+a+small-volume+recycling-%2C+perfusion-%2C+and+submersion-type+chamber+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Recording synaptic plasticity in acute hippocampal slices maintained in a small-volume recycling-, perfusion-, and submersion-type chamber system.</a> J Vis Exp. (131), e55936(2018).</li>
<li>Myers, P. Z., Eisen, J. S., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+axonal+outgrowth+of+identified+motoneurons+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Development and axonal outgrowth of identified motoneurons in the zebrafish.</a> J Neurosci. 6 (8), 2278-2289 (1986).</li>
<li>Westerfield, M., Mcmurray, J. V., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identified+motoneurons+and+their+innervation+of+axial+muscles+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identified motoneurons and their innervation of axial muscles in the zebrafish.</a> J Neurosci. 6 (8), 2267-2277 (1986).</li>
<li>Brehm, P., Wen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+neuromuscular+junction%3A+The+power+of+n%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Zebrafish neuromuscular junction: The power of n.</a> Neurosci Lett. 713, 134503(2019).</li>
<li>Ben Fredj, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+activity+and+activity-dependent+competition+regulates+axon+arbor+maturation%2C+growth+arrest%2C+and+territory+in+the+retinotectal+projection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic activity and activity-dependent competition regulates axon arbor maturation, growth arrest, and territory in the retinotectal projection.</a> J Neurosci. 30 (32), 10939-10951 (2010).</li>
<li>Mandal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+mitochondrial+transport+is+essential+for+organelle+distribution+and+health+in+zebrafish+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Retrograde mitochondrial transport is essential for organelle distribution and health in zebrafish neurons.</a> J Neurosci. 41 (7), 1371-1392 (2021).</li>
<li>Wong, H. C., Drerup, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+fluorescent+indicators+for+in+vivo+quantification+of+spontaneous+or+evoked+motor+neuron+presynaptic+activity+in+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Using fluorescent indicators for in vivo quantification of spontaneous or evoked motor neuron presynaptic activity in transgenic zebrafish.</a> STAR Protoc. 3 (4), 101766(2022).</li>
<li>Truckenbrodt, S., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+vesicle+recycling+in+the+synaptic+bouton%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spontaneous vesicle recycling in the synaptic bouton.</a> Front Cell Neurosci. 8, 409(2014).</li>
<li>Casey, J. R., Grinstein, S., Orlowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensors+and+regulators+of+intracellular+ph%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Sensors and regulators of intracellular ph.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (1), 50-61 (2010).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>40x Wasser-Immersionsobjektiv</td><td>Olympus</td><td>LUMPLFLN40XW</td><td></td></tr><tr><td>4ch Schwerkraft-Flow-Perfusionssystem</td><td>ALA</td><td>VCPlus-4G</td><td></td></tr><tr><td>5x Objektiv</td><td>Olympus</td><td>NPLN5X</td><td></td></tr><tr><td>Custum hergestellt Bildgebungskammer</td><td>Physiotech</td><td>custum gefertigt</td><td>Eine schwarze Acrylplatte (10,7 cm Durchmesser, 3 mm dick) mit einer Vertiefung (1 cm Durchmesser unten, 1,5 cm Durchmesser oben) ca. 0,5 ml Perfusat.</td></tr><tr><td>Digitales I/O-Gerät</td><td>Arduino</td><td>Uno Rev3</td><td></td></tr><tr><td>D-Tubocurarin Dichlorid Pentahydrat</td><td>Sigma</td><td>93750</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>Microsoft Office Professional Plus 2016</td><td></td></tr><tr><td>Fiji / imageJ</td><td>https://imagej.net/</td> <td>imageJ 1.54f</td><td></td></tr><tr><td>Feine Pinzette</td><td>AsOne</td><td>7-562-05 (Dumont #5)</td><td></td></tr><tr><td>Glas Pasteur Pipette</td><td>IWAKI</td><td>IK-PAS-5P</td><td>Die Spitze sollte getrimmt und feuerpoliert werden, bis der endgültige Durchmesser 1,5 % beträgt. 2 mm.&nbsp;</td></tr><tr><td>Glas Petrischale</td><td>AsOne</td><td>1-4564-06</td><td></td></tr><tr><td>Igor Pro</td><td>WaveMetrics</td><td>Ver. 6.37</td><td></td></tr><tr><td>Inline-Lösungsheizung</td><td>Warner Instruments</td><td>SF-28</td><td></td></tr><tr><td>LED-Beleuchtungssystem</td><td>X-cyte</td><td>XYLIS</td><td></td></tr><tr><td>Methylen blau</td><td>Wako</td><td>133-06962</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Manager</td><td>https://micro-manager.org/</td> <td>Ver. 2.0.0</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Magnetklemme für Perfusionsröhrchen</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1553</td><td></td></tr><tr><td>Motorisierter Mikromanipulator</td><td>Scientifica</td><td>PatchStar</td><td></td></tr><tr><td>Motorisierte bewegliche Probenplatte</td><td>Scientifica</td><td>MMSP</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenhalter</td><td>Narishige</td><td>H-13</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenabzieher</td><td>Narishige</td><td>PC-100</td><td></td></tr><tr><td>Platindraht (&phi; 0,1 mm)</td><td>Nilaco</td><td>PT-351165</td><td></td></tr><tr><td>Platindraht (&phi; 0.5 mm)</td><td>Niaco</td><td>PT-351381</td><td></td></tr><tr><td>Skalpell</td><td>AsOne</td><td>8-3086-02 (Feder #11)</td><td></td></tr><tr><td>Wissenschaftliche cMOS-Kamera</td><td>Thorlabs</td><td>CC215MU</td><td></td></tr><tr><td>Meersalz</td><td>NAPQO</td><td>Instant Ocean</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Olympus</td><td>SZX7</td><td></td></tr><tr><td>Stimulus-Isolator</td><td>AMPI</td><td>ISO-FLEX</td><td></td></tr><tr><td>Saugrohr</td><td>Warner Instruments</td><td>ST-3, 64-1406</td><td></td></tr><tr><td>Temperaturregler</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-324C</td><td></td></tr><tr><td>Thetaglas-Kapillare</td><td>Sutter Instrument</td><td>BT-150-10</td><td></td></tr><tr><td>Tricain (MS-222)</td><td>TCI</td><td>T0941</td><td></td></tr><tr><td>Aufrechtes Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td></td></tr></tbody></table>

live-bildgebung des synaptischen vesikelrecyclings in der neuromuskulären verbindung von sezierten zebrafischlarven

Live Imaging of Synaptic Vesicle Recycling in the Neuromuscular Junction of Dissected Larval Zebrafish

Wenn die präparierte Probe ohne schwere Gewebeschäden vorbereitet wird und die Stimulationselektrode korrekt in das Rückenmark eingeführt wird, kann durch hochfrequente elektrische Stimulation eine robuste pHluorin-Reaktion hervorgerufen werden (Abbildung 4D,E). Die Prästimulus-Ausgangsfluoreszenz war wahrscheinlich auf die Sonde zurückzuführen, die auf der Oberfläche der Präsynapse vorhanden war. Die Zunahme der Fluoreszenz während der Stimulation spiegelt die exozytotische...

Live-Bildgebung des synaptischen Vesikelrecyclings in der neuromuskulären Verbindung von sezierten Zebrafischlarven

Neuronal communication is mediated by synaptic transmission, which depends primarily on the release of neurotransmitters stored in synaptic vesicles (SVs) ...

Wir untersuchen den molekularen und zellulären Mechanismus der synaptischen Übertragung anhand der neuromaskären Verbindung von Zebrafischlarven als Modellsystem. Wir sind daran interessiert, die regulatorische Moderation der Synapse als Reaktion auf verschiedene physiologische und pathologische Zustände zu klären. Dieses Protokoll ermöglicht es uns, die durch Aktionspotentiale induzierte Neuübertragung in der neuromuskulären Verbindung von Zebrafischen der Larve mit verbesserter Sensitivität sichtbar zu machen.Wir können die synaptische Funktion überwachen, die durch moderate Stimulation hervorgerufen wird, was bisher nicht getestet wurde. Dieses Bildgebungsprotokoll kann unter einem herkömmlichen Epifluoreszenzmikroskop durchgeführt werden und erfordert nicht unbedingt ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop. Mit anderen Worten, diese Methode bietet im Vergleich zu anderen Versuchsaufbauten eine kostengünstige Plattform für die Abbildung der neuromuskulären Funktion.Zur Herstellung von 200 Millilitern der extrazellulären Lösung mischen Sie 6,4 Milliliter 3,5 molare Natriumchloride, 0,4 Milliliter ein molares Kaliumchlorid, 1 Milliliter ein molares HEPES, 0,4 Milliliter eines molaren Calciumchlorids, 0,2 Milliliter eines molaren Magnesiumchlorids und 360 Milligramm Glukose. Fügen Sie dann Reinstwasser hinzu, um das Gesamtvolumen auf 200 Milliliter zu bringen. Fügen Sie 20 Mikroliter 15 millimolare D-Tubocurarin-Stammlösung hinzu, um 100 Milliliter extrazelluläre Lösung mit 3 mikromolaren D-Tubourarin herzustellen.Zur Herstellung von 25 Millilitern der extrazellulären Lösung, die 0,02 % Tricain enthält, fügen Sie 0,5 Milliliter 1 %ige Tricain-Stammlösung zu 25 Millilitern Lösung hinzu. Ziehen Sie mit einem Mikropipettenabzieher an den Thetaglaskapillaren, bis der Spitzendurchmesser im Bereich von 3 bis 10 Mikrometern liegt. Füllen Sie die Pipette mit der extrazellulären Lösung.Führen Sie in jede Öffnung der Kapillare einen dünnen Platindraht ein und halten Sie die Pipettenelektrode aus Thetaglas an den Pipettenhalter des motorisierten Mikromanipulators. Verbinden Sie dann das Backend jedes Drahtes mit dem Stimulus-Isolator. Für 25 Milliliter extrazelluläre Lösung mit 0,02 % Tricain in eine Glas-Petrischale, geben Sie eine Zebrafischlarve zur Sektion in die Petrischale.Mit zwei feinen Pinzetten die Haut der Larven schälen. Halten Sie die Larven mit der ersten Pinzette fest und kneifen Sie mit der anderen Pinzette die Haut auf der dorsalen Seite der Schwimmblase zusammen. Entfernen Sie dann mit einem Skalpell die Schwimmblase, die inneren Organe und den Kopf.Verwenden Sie eine Glaspasteurpipette mit feuerpolierter Spitze, um die präparierte Zebrafischprobe in die Bildgebungskammer zu übertragen. Fixieren Sie die Probe mechanisch mit einem Nylonfaden, der auf einen C-förmigen Platindraht geklebt ist, um sie in einem Winkel auszurichten, der ungefähr parallel zur Stimulationselektrode verläuft. Die Probe wird unter Verwendung eines Schwerkraftflusssystems mit einer Geschwindigkeit von 1 Milliliter pro Minute mit einer extrazellulären Lösung perfundiert, die 3 mikromolare D-Tubocurarin enthält.Führen Sie anschließend die Stimulationselektrode in das Rückenmark ein. Positionieren Sie die Elektrodenspitze vorsichtig in der Nähe der spinalen Motoneuronen, die als TagRFP-positive Neuronen auf der ventralen Seite des Rückenmarks identifiziert werden. Schieben Sie die Elektrode in einem schrägen Winkel vom angrenzenden Segment in die Zielposition.Um an einem Computer zu beginnen, wählen Sie den Bildgebungsbereich basierend auf dem Live-Bild der TagRFP-Fluoreszenz aus. Stellen Sie sicher, dass der ausgewählte Bereich mehrere Boutons enthält und diejenigen in der Nähe der Körpersegmentgrenze ausschließt. Schalten Sie die Fluoreszenzfiltereinheit GFP Fluorfluoreszenz für die Bildgebung um.Passen Sie anschließend die Intensität der Lichtquelle an, um ein helles Bild im 1-Hertz-Zeitraffermodus ohne Sättigung zu erhalten. Geben Sie die Belichtungszeit bis 100 in das Feld Belichtungsmillisekunden des Mikromanager-Fensters ein. Konfigurieren Sie die Bilderfassungssoftware und das digitale Eingabeausgabegerät, um die Bildaufnahme mit der elektrischen Stimulation zu synchronisieren.Bestimmen Sie als Nächstes die Stimulationsfrequenz, die Anzahl der Aktionspotentiale und die Zeitverzögerung zwischen dem Beginn der Bildaufnahme und der Stimulationsabgabe im Arduino-Skript. Berechnen Sie auf der Grundlage dieser Einstellungen die Gesamtzahl der Bilder, die für die Erfassung erforderlich sind, und geben Sie diesen Wert in das Zählfeld des multidimensionalen Aufnahmefensters im Mikromanager ein. Legen Sie im Intervallfeld ein Intervall von 1 Sekunde für die 1-Hertz-Zeitrafferaufnahme fest.Für die elektrische Stimulation konfigurieren Sie den Stimulus-Isolator so, dass er 1-Millisekunden-Impulse mit konstanter Spannung von 70 Millivolt liefert. Führen Sie den Digitizer-Befehl aus, um die Bildaufnahme zu starten. Überwachen Sie den Prozess, um sicherzustellen, dass keine inakzeptable Bilddrift vorliegt und dass Fluor und Reaktionen beobachtbar sind.Ändern Sie die Stimulationsintensität, z. B. die Frequenz in der Anzahl der Impulse, oder passen Sie die Temperatur je nach Versuchszweck an. Speichern Sie die Zeitrafferbilder als TIFF-Zeitreihenstapel. Synapsen mit großen Signalanstiegen wurden für die Analyse ausgewählt, obwohl alle Boutons nachweisbare Veränderungen in der 20-Hertz-100-Aktionspotentialbedingung zeigten. Robuste Fluorreaktionen wurden bei hochfrequenter elektrischer Stimulation beobachtet, wobei Fluoreszenzänderungen auf eine Exozytose während der Stimulation und den anschließenden Zerfall hindeuteten, was die Endozytose und Wiedersäuerung der synaptischen Vesikel widerspiegelt.Die Fluoreszenz-Abklingzeitkonstanten variierten mit Stimulus, Intensität und Temperatur, wobei 20 Hertz 25 Aktionspotentiale bei 16,6 Sekunden, 20 Hertz 100 Aktionspotentiale bei 56,8 Sekunden und 50 Hertz 500 Aktionspotentiale bei 62,7 Sekunden angezeigt wurden.

live-imaging-synaptic-vesicle-recycling-neuromuscular-junction

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Dieses Protokoll beschreibt Abbildung von einzelnen Neuronen oder Neuralleistenzellen in lebenden Zebrafisch-Embryonen. Diese Methode wird verwendet, um zelluläre Verhaltensweisen und Aktin-Lokalisierung mittels Fluoreszenz konfokalen Zeitraffer-Mikroskopie zu untersuchen.

Live-Imaging von Zellbewegung und Aktin-Zytoskelett von einzelnen Neuronen und Zellen der Neuralleiste in Zebrafisch-Embryos

In-vivo-Visualisierung von synaptischen Vesikeln Innerhalb Drosophila Larven Segmentale Axone

Larven Zebrafisch sind die ersten Wirbeltiere Modellsystem zur gleichzeitigen Patch-Clamp-Aufnahme von einem spinalen motorischen Neuronen-und Ziel-Skelettmuskel ermöglichen. Dieses Video zeigt die mikroskopische Methoden verwendet, um eine segmentale CaP Motor-Neuron-und Ziel-Muskelzellen sowie die Methoden für die Aufzeichnung von jedem Zelltyp zu identifizieren.

Gepaart Patch Clamp Messungen von Motor-Neuron-und Target Skelettmuskulatur bei Zebrafisch

Dissection und Imaging von aktiven Zonen in der Drosophila Neuromuskulären Synapse

Eine einfache Mikrofluidikvorrichtung wurde entwickelt, um Anästhetikum frei...

Einfache mikrofluidischen Systemen für<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging der<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; Und Zebrafisch

Dieses Video demonstriert ein Protokoll zur Untersuchung des synaptischen Vesikelrecyclings an neuromuskulären Verbindungen in Channelrhodopsin-exprimierenden Drosophila-Larven unter Verwendung eines Fluoreszenzfarbstoffs. Blaues Licht aktiviert die Kanalrhodopsine, was zu Kalziumeinstrom und synaptischer Vesikelexozytose führt. Der Farbstoff integriert sich in die neuronalen Membranen und wird während der Endozytose internalisiert, was zu einer verstärkten Fluoreszenz führt. Eine weitere...

Analyse des synaptischen Vesikelrecyclings und der Aufnahme von Fluoreszenzfarbstoffen in Drosophila-Larven

Quelle: Schramm, P. et al. In vivo Bildgebung von voll aktivem Hirngewebe bei wachen Zebrafischlarven und Jungtieren durch Schädel- und Hautentfernung. J. Vis. Exp. (2021)Dieses Video zeigt die In-vivo-Bildgebung von Kleinhirnneuronen in transgenen Zebrafischlarven, die fluoreszierende Proteine in Purkinje-Neuronen exprimieren. Der Prozess beinhaltet die Betäubung der Larven, die Immobilisierung in Agarose und die vorsichtige Entfernung der pigmentierten Haut, um die Lichtdurchdringung und die...

In vivo Bildgebung des Gehirns von Zebrafischlarven zur Visualisierung von Kleinhirnneuronen

Quelle: Lukasz, D., et al. In vivo Calcium-Bildgebung von Seitenhaarzellen bei Zebrafischlarven. J. Vis. Exp. (2018)Dieses Video zeigt eine Live-Bildgebung des Kalziumeinstroms in den Seitenlinien-Haarzellen einer gelähmten transgenen Zebrafischlarve mit einem konfokalen Mikroskop. Die mechanische Stimulation der Haarbündel über Flüssigkeitsimpulse induziert den Kalziumeintrag über Mechanotransduktionskanäle und spannungsgesteuerte Kanäle, der in Echtzeit mit Hilfe von Fluoreszenzindikatoren...

Bildgebung der Kalziumdynamik in Seitenlinien-Haarzellen von Zebrafischlarven

Der Zebrabärbling ist ein Modell, das hat viele wertvolle Eigenschaften einschließlich optischen Klarheit, schnelle externe Entwicklung und von besonderer Bedeutung auf dem Gebiet der Gehör und Gleichgewicht befindet sich extern sensorischen Haarzellen. Dieser Artikel beschreibt wie transgene Zebrafisch Haarzelle Mechanosensation und präsynaptischen Funktion in toto assay genutzt werden.

In Vivo Calcium Imaging der Seitenlinie Haarzellen im Larvenstadium Zebrafisch

Wir demonstrieren eine Methode, die die Vorteile der schnellen konfokalen Rastermikroskopie nutzt, um Live-Bildgebung von Mikrogliazellen im sich entwickelnden optischen Tectum des Zebrafisches durchzuführen und so die Dynamik dieser Zellen in vivo zu analysieren.

Live-Bildgebung und Charakterisierung der Mikroglia-Dynamik im Zebrafischembryo

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll vor, um die neuronale Aktivität in Gehirnregionen transgener Zebrafische, die GCaMP-Kalziumindikatoren exprimieren, mittels konfokaler Mikroskopie zu untersuchen.

Im lebenden Organismus Konfokale Fluoreszenzbildgebung der durch sensorische Stimulation induzierten neuronalen Aktivität bei teilweise gefesselten Zebrafischlarven

Erfahren Sie die Live-Bildgebung synaptischer Vesikelrecycling-Prozesse an der neuromuskulären Verbindung von sezierten Zebrafischlarven mit pHluorin-basierter Fluoreszenztechnik. Diese kosteneffiziente Methode ermöglicht die Untersuchung synaptischer Übertragung unter physiologischen und pathologischen Bedingungen.

Live-Bildgebung des synaptischen Vesikelrecyclings in der neuromuskulären Verbindung von sezierten Zebrafischlarven

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