Live-Bildgebung des synaptischen Vesikelrecyclings in der neuromuskulären Verbindung von sezierten Zebrafischlarven

Wir untersuchen den molekularen und zellulären Mechanismus der synaptischen Übertragung anhand der neuromaskären Verbindung von Zebrafischlarven als Modellsystem. Wir sind daran interessiert, die regulatorische Moderation der Synapse als Reaktion auf verschiedene physiologische und pathologische Zustände zu klären. Dieses Protokoll ermöglicht es uns, die durch Aktionspotentiale induzierte Neuübertragung in der neuromuskulären Verbindung von Zebrafischen der Larve mit verbesserter Sensitivität sichtbar zu machen.

Wir können die synaptische Funktion überwachen, die durch moderate Stimulation hervorgerufen wird, was bisher nicht getestet wurde. Dieses Bildgebungsprotokoll kann unter einem herkömmlichen Epifluoreszenzmikroskop durchgeführt werden und erfordert nicht unbedingt ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop. Mit anderen Worten, diese Methode bietet im Vergleich zu anderen Versuchsaufbauten eine kostengünstige Plattform für die Abbildung der neuromuskulären Funktion.

Zur Herstellung von 200 Millilitern der extrazellulären Lösung mischen Sie 6,4 Milliliter 3,5 molare Natriumchloride, 0,4 Milliliter ein molares Kaliumchlorid, 1 Milliliter ein molares HEPES, 0,4 Milliliter eines molaren Calciumchlorids, 0,2 Milliliter eines molaren Magnesiumchlorids und 360 Milligramm Glukose. Fügen Sie dann Reinstwasser hinzu, um das Gesamtvolumen auf 200 Milliliter zu bringen. Fügen Sie 20 Mikroliter 15 millimolare D-Tubocurarin-Stammlösung hinzu, um 100 Milliliter extrazelluläre Lösung mit 3 mikromolaren D-Tubourarin herzustellen.

Zur Herstellung von 25 Millilitern der extrazellulären Lösung, die 0,02 % Tricain enthält, fügen Sie 0,5 Milliliter 1 %ige Tricain-Stammlösung zu 25 Millilitern Lösung hinzu. Ziehen Sie mit einem Mikropipettenabzieher an den Thetaglaskapillaren, bis der Spitzendurchmesser im Bereich von 3 bis 10 Mikrometern liegt. Füllen Sie die Pipette mit der extrazellulären Lösung.

Führen Sie in jede Öffnung der Kapillare einen dünnen Platindraht ein und halten Sie die Pipettenelektrode aus Thetaglas an den Pipettenhalter des motorisierten Mikromanipulators. Verbinden Sie dann das Backend jedes Drahtes mit dem Stimulus-Isolator. Für 25 Milliliter extrazelluläre Lösung mit 0,02 % Tricain in eine Glas-Petrischale, geben Sie eine Zebrafischlarve zur Sektion in die Petrischale.

Mit zwei feinen Pinzetten die Haut der Larven schälen. Halten Sie die Larven mit der ersten Pinzette fest und kneifen Sie mit der anderen Pinzette die Haut auf der dorsalen Seite der Schwimmblase zusammen. Entfernen Sie dann mit einem Skalpell die Schwimmblase, die inneren Organe und den Kopf.

Verwenden Sie eine Glaspasteurpipette mit feuerpolierter Spitze, um die präparierte Zebrafischprobe in die Bildgebungskammer zu übertragen. Fixieren Sie die Probe mechanisch mit einem Nylonfaden, der auf einen C-förmigen Platindraht geklebt ist, um sie in einem Winkel auszurichten, der ungefähr parallel zur Stimulationselektrode verläuft. Die Probe wird unter Verwendung eines Schwerkraftflusssystems mit einer Geschwindigkeit von 1 Milliliter pro Minute mit einer extrazellulären Lösung perfundiert, die 3 mikromolare D-Tubocurarin enthält.

Führen Sie anschließend die Stimulationselektrode in das Rückenmark ein. Positionieren Sie die Elektrodenspitze vorsichtig in der Nähe der spinalen Motoneuronen, die als TagRFP-positive Neuronen auf der ventralen Seite des Rückenmarks identifiziert werden. Schieben Sie die Elektrode in einem schrägen Winkel vom angrenzenden Segment in die Zielposition.

Um an einem Computer zu beginnen, wählen Sie den Bildgebungsbereich basierend auf dem Live-Bild der TagRFP-Fluoreszenz aus. Stellen Sie sicher, dass der ausgewählte Bereich mehrere Boutons enthält und diejenigen in der Nähe der Körpersegmentgrenze ausschließt. Schalten Sie die Fluoreszenzfiltereinheit GFP Fluorfluoreszenz für die Bildgebung um.

Passen Sie anschließend die Intensität der Lichtquelle an, um ein helles Bild im 1-Hertz-Zeitraffermodus ohne Sättigung zu erhalten. Geben Sie die Belichtungszeit bis 100 in das Feld Belichtungsmillisekunden des Mikromanager-Fensters ein. Konfigurieren Sie die Bilderfassungssoftware und das digitale Eingabeausgabegerät, um die Bildaufnahme mit der elektrischen Stimulation zu synchronisieren.

Bestimmen Sie als Nächstes die Stimulationsfrequenz, die Anzahl der Aktionspotentiale und die Zeitverzögerung zwischen dem Beginn der Bildaufnahme und der Stimulationsabgabe im Arduino-Skript. Berechnen Sie auf der Grundlage dieser Einstellungen die Gesamtzahl der Bilder, die für die Erfassung erforderlich sind, und geben Sie diesen Wert in das Zählfeld des multidimensionalen Aufnahmefensters im Mikromanager ein. Legen Sie im Intervallfeld ein Intervall von 1 Sekunde für die 1-Hertz-Zeitrafferaufnahme fest.

Für die elektrische Stimulation konfigurieren Sie den Stimulus-Isolator so, dass er 1-Millisekunden-Impulse mit konstanter Spannung von 70 Millivolt liefert. Führen Sie den Digitizer-Befehl aus, um die Bildaufnahme zu starten. Überwachen Sie den Prozess, um sicherzustellen, dass keine inakzeptable Bilddrift vorliegt und dass Fluor und Reaktionen beobachtbar sind.

Ändern Sie die Stimulationsintensität, z. B. die Frequenz in der Anzahl der Impulse, oder passen Sie die Temperatur je nach Versuchszweck an. Speichern Sie die Zeitrafferbilder als TIFF-Zeitreihenstapel. Synapsen mit großen Signalanstiegen wurden für die Analyse ausgewählt, obwohl alle Boutons nachweisbare Veränderungen in der 20-Hertz-100-Aktionspotentialbedingung zeigten. Robuste Fluorreaktionen wurden bei hochfrequenter elektrischer Stimulation beobachtet, wobei Fluoreszenzänderungen auf eine Exozytose während der Stimulation und den anschließenden Zerfall hindeuteten, was die Endozytose und Wiedersäuerung der synaptischen Vesikel widerspiegelt.

Die Fluoreszenz-Abklingzeitkonstanten variierten mit Stimulus, Intensität und Temperatur, wobei 20 Hertz 25 Aktionspotentiale bei 16,6 Sekunden, 20 Hertz 100 Aktionspotentiale bei 56,8 Sekunden und 50 Hertz 500 Aktionspotentiale bei 62,7 Sekunden angezeigt wurden.