Beurteilung der mikroglialen Phagozytose von Myelintrümmern in vitro unter wiederholter Magnetstimulation

[Dozent] Der Schwerpunkt unserer Studie liegt auf der Forschung in der Neurorehabilitation und der magnetischen Simulationstherapie. Dieses Protokoll kann neue Ideen für die Magnetstimulation liefern, indem es erforscht, wie sie eine klare Funktion beeinflusst. Wir werden uns in Zukunft auf die Neurorehabilitation und Magnetstimulationstherapie konzentrieren.

[Dozent] Besorge dir zunächst den abgetrennten Kopf einer weiblichen Ratte. Präparieren Sie den Kopf auf Eis. Halbieren Sie den Schädel mit einer Schere, um das Gehirn vollständig freizulegen und seine vollständige Entfernung zu erleichtern. Verwenden Sie eine Schere und eine Pinzette, um die Membranen, das Kleinhirn und den Hippocampus akribisch und aseptisch zu entfernen. Reinigen Sie das Gehirn dreimal mit PBS, um Blut- oder Gewebereste zu entfernen. Übertragen Sie das gereinigte Gehirn auf 10 Milliliter 0,32 molare sterile Saccharoselösung. Schneiden Sie das Hirngewebe mit einer mikrochirurgischen Schere in Stücke, um eine Mischung aus Hirngewebe und Saccharose zu erhalten. Übertragen Sie als Nächstes das Hirngewebe-Saccharose-Gemisch in einen sterilen 50-Milliliter-Homogenisator. Fügen Sie 30 Milliliter 0,32 molare sterile Saccharoselösung hinzu. Verwenden Sie einen 50-Milliliter-Glashomogenisator, um das Gewebe zwei Minuten lang zu mahlen. Um ein glattes Gehirngewebe zu erhalten, homogenisieren Sie es. Verdünnen Sie das Homogenat des Gehirngewebes auf 90 Milliliter mit 0,32 molaren sterilen Saccharoselösung und mischen Sie es gründlich. Geben Sie 20 Milliliter sterile Saccharoselösung von 0,83 molaren in sechs sterile, dünnwandige Polypropylen-Ultrazentrifugenröhrchen. Geben Sie dann langsam 15 Milliliter des Gehirngemisches in den oberen Teil der Röhrchen ab. Nivellieren Sie die Volumina mit 0,32 molaren sterilen Saccharoselösung. Um die rohen Myelinreste aufzufangen, kühlen Sie den Rotor zuerst vor und zentrifugieren Sie ihn bei vier Grad Celsius. Zentrifugieren Sie die Probe 45 Minuten lang bei 75.000 g und sammeln Sie dann mit einer sterilen Weidepipette die Myelinreste von der Grenzfläche zwischen den beiden Saccharosedichten. Für die erste isotonische Trennung und Reinigung wird die gesammelte Myelin-Trümmerlösung in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt. Stellen Sie das Volumen mit vorgekühltem sterilem PBS auf 35 Milliliter ein und geben Sie es in ein neues Homogenisatorröhrchen. Nach dreiminütiger Homogenisierung wird das Homogenat der Myelinrückstände gleichmäßig in sechs sterilen, dünnwandigen Polypropylen-Ultrazentrifugenröhrchen mit einem Fassungsvermögen von 38,5 Millilitern verteilt. Füllen Sie das Volumen mit sterilem PBS auf und zentrifugieren Sie dann. Für die zweite isotonische Trennung und Reinigung resuspendieren Sie das feste weiße Pellet in 10 Millilitern vorgekühltem sterilem PBS, um eine Myelin-Rückstandssuspension zu erhalten. Die Suspension wie zuvor in Ultrazentrifugenröhrchen verteilen und zentrifugieren. Nach dem Zentrifugieren ist der Überstand zu verwerfen. Resuspendieren Sie das feste weiße Pellet in sechs Millilitern sterilem PBS. Teilen Sie die Myelin-Trümmersuspension in sechs 1,5-Zentrifugenröhrchen auf und zentrifugieren Sie erneut. Zum Schluss wird das Pellet in 100 Mikrolitern vorgekühltem sterilem PBS resuspendiert, nachdem der Überstand verworfen wurde. Tauen Sie die erforderlichen Myelinreste bei vier Grad Celsius oder in Eiswasser auf und zentrifugieren Sie wie zuvor 10 Minuten lang. Resuspendieren Sie die Myelinreste in 200 Mikrolitern 50 mikromolare CFSE-Lösung. Die Suspension wird bei Raumtemperatur im Dunkeln 30 Minuten lang inkubiert, dann erneut zentrifugiert. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie die Proben dreimal mit 500 Mikrolitern sterilem PBS. Resuspendieren Sie die Myelinreste in 100 Mikrolitern vorgekühltem sterilem PBS, um eine Suspension aus fluoreszenzmarkierten Myelinresten zu erhalten. Lagern Sie die Probe bis zur weiteren Verwendung bei -80 Grad Celsius. Für die wiederholte In-vitro-Magnetstimulation stellen Sie die Behandlungsfrequenz auf 20 Hertz, die Behandlungsintensität auf 1 % der maximalen Ausgangsintensität und die Stimulationszeit auf fünf Sekunden ein. Gönnen Sie sich eine Ruhephase von 20 Sekunden und verabreichen Sie 600 Impulse über eine einzige Behandlungszeit von 2,5 Minuten. Nachdem Sie die Magnetstimulationsparameter vorbestimmt haben, fixieren Sie die Richtung der Spule senkrecht zum Boden und richten Sie sie nach oben aus. Sterilisieren Sie die Magnetstimulationsspirale mit Alkohol, um eine Zellkontamination zu verhindern. Nach der Zugabe von 50 Mikromolaren CFSE werden 1.000 BV-2-Zellen über Nacht in 24-Well-Platten plattiert, dann das alte Medium mit einer Pipette aspiriert und sofort frisches serumfreies Medium hinzugefügt. Wechseln Sie das Medium auf serumfreies Medium und behandeln Sie die Zellen 12 Stunden lang mit einem Mikrogramm pro Milliliter Lipopolysaccharid. Nach 12-stündiger Lipopolysaccharid-Intervention geben Sie 100 Mikrogramm pro Milliliter Myelinreste in das Medium für die Co-Kultur im Dunkeln. Setzen Sie die Zellen einer wiederholten magnetischen Stimulation aus, wie bereits gezeigt. Sprühen Sie Alkohol über die Platte, um sie zu sterilisieren, bevor Sie sie wieder in den Inkubator geben. Waschen Sie nach einer Zeit der Co-Kultur mit Myelinfragmenten nicht absorbierte Myelinreste vorsichtig mit PBS. Fixieren Sie die Zellen 15 Minuten lang mit 4% Paraformaldehyd. Geben Sie anschließend 150 Mikroliter PBS mit 10 % Eselserumalbumin und 0,3 % Triton X-100 in die Vertiefungen und inkubieren Sie. Nachdem Sie die Vertiefungen mit PBS gewaschen haben, geben Sie eine primäre Antikörperlösung im Verhältnis 100 bis 200 in die Vertiefungen und inkubieren Sie sie in der Kälte. Dann inkubieren Sie die Zellen in einem Sekundärantikörper in einem Verhältnis von 100 bis 300 für zwei Stunden bei Raumtemperatur, bevor Sie mit einem konfokalen Mikroskop abbilden. BV-2-Mikrogliazellen zeigten nach einer Behandlung mit Lipopolysacchariden eine signifikante Verringerung der Phagozytose von Myelintrümmern. die sich bei wiederholter Magnetstimulation umkehrte. Die quantitative Analyse bestätigte eine signifikante Abnahme der Myelin-Trümmerfläche in BV-2-Zellen in der Lipopolysaccharid-Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe, mit einer bemerkenswerten Zunahme in der mit Lipopolysaccharid-behandelten magnetisch stimulierten Gruppe. Der Prozentsatz der IBA-1-positiven Mikroglia, die mit Myelin-Trümmern kolokalisiert waren, war in der LPS-Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant niedriger, während die Magnetstimulation diesen Prozentsatz signifikant erhöhte. Ein zeitabhängiger Anstieg der mikroglialen Phagozytose wurde in der mit Lipopolysaccharid behandelten magnetisch stimulierten Gruppe für unsere Gruppe beobachtet, die eine signifikant höhere Aufnahme von Myelintrümmern zeigte.