Kryosektion und Immunfärbung von Innenohrgewebe von Mäusen: vom Embryonalstadium bis zum Erwachsenenstadium

Meine Forschung konzentriert sich auf die neurologische Entwicklung der Cochlea. Konkret möchte ich die zugrundeliegenden Mechanismen der SNAPS-Bildung in der Cochlea aufdecken und den Zusammenhang zwischen Alzheimer und Hörverlust untersuchen. Live-Bildgebung und genetische Werkzeuge verbessern unsere Fähigkeit, Cochlea-Strukturen und neuronale Schaltkreise detaillierter zu untersuchen, und ermöglichen so tiefere Einblicke in die Widerstandsfähigkeit und Funktionsstörung von Hörsystemen. Mit der Veröffentlichung dieses Protokolls möchten wir Forschern helfen, die neu in der Wirtschaftsprüfungswissenschaft sind, insbesondere denen, die noch nie mit Cochlea gearbeitet haben. In dieser Anleitung wird Schritt für Schritt erklärt, wie Innenohrproben von embryonalen, neugeborenen und adulten Mäusen vorbereitet werden. Unser Ziel ist es, Innenohrexperimente zu erleichtern und sicherzustellen, dass die Ergebnisse zuverlässig und konsistent sind. Die Querschnitts-Immunfärbung hat mehrere Vorteile gegenüber anderen Methoden, wie z. B. der Ganz-Mount-Immunfärbung. Es konserviert Proteine und Nukleinsäuren gut und erstellt dünne, fast 2D-Schnitte, was die Messungen genauer und konsistenter macht. Bei dieser Methode bleiben auch alle Cochlea-Zelltypen intakt und sichtbar, was den Kult der Immunfärbung verbessert. Im Gegensatz zu Ganzpräparationen bleiben beim Querschnitt wichtige Strukturen wie das Spiralband, die Stria vascularis, die Reissner-Membran und die Tektorialmembran erhalten.

[Dozent] Zu Beginn legen Sie die juvenile euthanasierte Maus auf eine chirurgische Plattform. Machen Sie mit einer feinen Präparierschere vorsichtig einen Schnitt in der Mittellinie entlang der Kopfhaut, beginnend am Hals und bis zur Schnauze. Legen Sie dann die untere Klinge der Schere auf das Foramen magnum und die obere Klinge auf den Schädel. Schneide die obere Hälfte des Schädels bis zur Nase ab, um den zweiten Schnitt zu vollenden. Ziehen Sie die Schere aus dem teilweise eingeschnittenen Kopf zurück. Platzieren Sie die untere Klinge der Schere an der Unterseite des Schädels und die obere Klinge am Foramen magnum. Schneide die untere Hälfte des Kopfes bis zur Nase ab, um den dritten Schnitt zu vollenden. Lösen Sie mit einer feinen Zange und einer Schere vorsichtig das Weichgewebe, das das Schläfenbein umgibt, einschließlich Gehirn, Muskeln und Bindegewebe. Legen Sie als Nächstes die halben Köpfe der Maus in die Vertiefungen einer 24-Well-Platte, die PBS enthält. Ersetzen Sie das PBS durch 4%ige Paraformaldehydlösung zur Fixierung und inkubieren Sie es 45 Minuten lang bei Raumtemperatur. Spülen Sie das Gewebe nach der Fixierung dreimal für fünf bis 10 Minuten mit PBS aus. Lokalisieren Sie das Schläfenbein oder die Innenohrkapsel im Halbkopf der Maus. Lösen Sie mit einer feinen Pinzette vorsichtig das Weichgewebe, das die Innenohrkapsel umgibt. Schneiden Sie nach dem Lockern das Gewebe um die Innenohrkapsel auf. Üben Sie dann mit einer Pinzette sanften Druck auf den Bereich um die Innenohrkapsel aus, um sie vollständig zu befreien. Lagern Sie die Innenohrproben in PBS bei vier Grad Celsius. Platzieren Sie zunächst die erwachsene euthanasierte Maus auf einer chirurgischen Plattform. Machen Sie mit einer scharfen Präparierschere einen Schnitt in der Mittellinie entlang der Kopfhaut, beginnend am Hals und bis zur Schnauze. Falten Sie die Haut zurück, um den Schädel während des ersten Schnitts freizulegen. Platzieren Sie die untere Klinge der Schere am Foramen magnum und die obere Klinge am Schädel. Schneide die obere Hälfte des Schädels bis zur Nase ab, um den zweiten Schnitt zu vollenden. Ziehen Sie die Schere aus dem teilweise eingeschnittenen Kopf zurück. Positionieren Sie die untere Klinge an der Schädelbasis und die obere Klinge an der Foramen magnum. Schneide die untere Hälfte des Kopfes bis zur Nase entlang der Mittellinie und vermeide dabei die Innenohren. Verwenden Sie für jeden halben Kopf eine Zange und eine Schere, um das Weichgewebe zu lösen, das das Schläfenbein umgibt, einschließlich Gehirn, Muskeln und Bindegewebe. Als nächstes wickeln Sie das Schädelgewebe mit den Fingern rückwärts und üben mit dem Daumen sanften Druck auf die Unterseite des Schläfenbeins aus. Lösen Sie den Knochen nach und nach von den umgebenden Ansätzen. Sobald die Innenohrkapsel entfernt ist, spülen Sie sie gründlich mit PBS aus. Legen Sie eine mit 4 % Paraformaldehyd gefüllte Sylgard-Schale unter das Mikroskop. Positionieren Sie eine einzelne Innenohrkapsel in der Schale. Untersuche das Innenohr auf anhaftendes Weichgewebe oder Knochen und entferne es vorsichtig. Identifizieren Sie das ovale Fenster und entfernen Sie die Steigbügel vorsichtig mit einer Pinzette. Öffnen Sie dann mit einer feinen Pinzette ein kleines Loch in der Spitze der Cochlea. Spülen Sie mit einer P20-Pipette, die mit 4 % Paraformaldehyd gefüllt ist, die Cochlea, um sicherzustellen, dass Flüssigkeiten wie verdünntes Blut oder Endolymphe durch das ovale Fenster austreten. Übertragen Sie die fixierte Cochlea in eine 24-Well-Platte, die mit 4 % Paraformaldehyd gefüllt ist. Markieren Sie die Uhrzeit und inkubieren Sie 30 bis 60 Minuten lang unter leichtem Rühren mit einer Wippe oder einem Nutator. Spülen Sie die Probe nach der Inkubation dreimal für fünf bis 10 Minuten mit PBS. Legen Sie die Cochlea nach der letzten Spülung in 1,25 Millimolare EDTA und lassen Sie sie zwei bis drei Tage lang bei vier Grad Celsius schaukeln. Spülen Sie die Cochlea nach der EDTA-Behandlung dreimal für fünf Minuten mit PBS. Legen Sie die präparierte Innenohrkapsel zunächst in 10%ige Saccharoselösung und inkubieren Sie sie zwei Stunden lang bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation die 10%ige Saccharoselösung durch 20%ige Saccharose ersetzen und weitere zwei Stunden inkubieren. Ersetzen Sie dann die 20%ige Saccharoselösung durch 30%ige Saccharose und inkubieren Sie die Probe über Nacht bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag die Hälfte der 30%igen Saccharoselösung entfernen. Füllen Sie den Raum mit optimaler Schnitttemperatur oder OCT-Verbindung und lassen Sie die Probe 30 Minuten bis zwei Stunden lang schaukeln. Übertragen Sie die Proben in markierte Kryoformen, die mit OCT-Verbindung gefüllt sind. Überprüfen Sie die Ausrichtung der Cochlea im eingebetteten Kryoblock. Sichern Sie das Innenohr; Die konkave Seite zeigt zu den schmalen Seiten des Kryomolds für Standard-Cochlea-Querschnitte. Geben Sie anschließend Trockeneis in einen kleinen Behälter und fügen Sie fünf bis 10 Milliliter Dimethylbutan hinzu. Legen Sie die Kryoformen mit dem OCT und der Probe auf das blubbernde Trockeneis, um den Block schnell einzufrieren. Bringen Sie die Kryoblöcke in die auf minus 20 Grad Celsius vorgekühlte Kammer eines Kryostaten. Lassen Sie die Proben 30 bis 60 Minuten lang äquilibrieren. Markieren Sie mit einem Bleistift oder Kugelschreiber die Seite des Kryoblocks, die der Cochlea-Position entspricht, um die richtige Ausrichtung für die Schnitte zu gewährleisten. Geben Sie als Nächstes eine kleine Lache OCT in das Futter und platzieren Sie den Kryoblock darauf, wobei Sie darauf achten, dass die breite Seite ohne die Bleistiftmarkierung nach unten zeigt. Stellen Sie das Spannfutter mit dem OCT und der Probe in die gekühlte Kryostatkammer, so dass das OCT vollständig einfrieren kann. Positionieren Sie nach einigen Minuten das Spannfutter mit der Probe auf dem Futterhalter, wobei die Bleistiftmarkierung nach rechts oder links zeigt. Schneiden Sie den Block auf einem Kryostaten mit einer 40-Mikrometer-Einstellung ab, bis das Gewebe sichtbar wird. Sobald das Gewebe sichtbar ist, entnehmen Sie einen 12-Mikrometer-Schnitt mit Objektträgern, die für die Kryosektion ausgelegt sind. Überprüfen Sie die Lage des Schnitts unter dem Mikroskop. Wenn Sie sich Cochlea-Windungen nähern, fahren Sie mit der Entnahme von 12-Mikrometer-Schnitten fort und überprüfen Sie die Position regelmäßig, bis alle Cochlea-Windungen geschnitten sind.