Isolierung von lebenden myeloischen und epithelialen Zellpopulationen aus der Lunge der Maus

Wir untersuchen die Lungenreparatur nach einer Virusinfektion. Unser Ziel ist es, die Mechanismen zu verstehen, durch die Immunzellen die epitheliale Reparatur vermitteln und wie sich der Umbau nach einer Virusverletzung und die anschließende Reparatur auf zukünftige Krankheitspathologien auswirken kann. Dieses Protokoll befasst sich mit der Inkompatibilität von Lungenverdauen, die entweder für Epithel- und Stromazellen oder Immunzellen optimiert sind.

Unsere Forschung erfordert die Isolierung lebensfähiger Zellen sowohl aus immunen als auch aus nicht-immunen Kompartimenten. Darüber hinaus haben wir eine Gating-Strategie für Epithel- und Makrophagen-Untergruppen vorgeschlagen, von der wir hoffen, dass sie dem Feld zugute kommen wird. Unser Labor untersucht die Wechselwirkung zwischen Immun- und Epithelzellen in den Atemwegen unter stationären Bedingungen und als Reaktion auf Umwelteinflüsse.

Unser oberstes Ziel ist es, herauszufinden, wie wir diese Kommunikation am besten modulieren können, um die Gewebereparatur zu verbessern und die Entwicklung von Krankheiten zu verhindern. Besprühen Sie die Maus zunächst mit 70% Ethanol. Machen Sie mit einer feinen chirurgischen Schere und einer Zange Nummer sieben einen Schnitt in den Bauch und schneiden Sie seitlich durch das Bauchfell.

Machen Sie einen kleinen Schnitt in die Membran, um das Vakuum abzulassen. Schneiden Sie dann das Zwerchfell und den unteren Brustkorb aus der Körperhöhle heraus, um die Lunge und das Herz freizulegen. Mit einer 10-Milliliter-Spritze, die mit einer 27-Gauge-Nadel versehen ist, perfundieren Sie die Lunge mit fünf Millilitern zwei Millimolar EDTA in DPBS.

Schneiden Sie vertikal durch das Brustbein und entlang der Seiten, um den Brustkorb zu öffnen und die Luftröhre freizulegen. Verwenden Sie eine feine Schere und eine Zange mit der Nummer sieben, um so viel Muskel- und Bindegewebe wie möglich zu entfernen, ohne die Luftröhre oder die Lunge zu durchstechen. Wickeln Sie anschließend die Luftröhre mit einer 2/0-Naht ein und positionieren Sie sie so, als ob Sie sie abbinden möchten, aber ziehen Sie sie nicht fest.

Machen Sie einen seitlichen Schnitt in die Luftröhre und führen Sie den Katheter ein. Ziehen Sie dann die Naht fest, um den Katheter an Ort und Stelle zu halten. Blasen Sie die Lunge mit einem Milliliter DPBS mit einer Spritze auf.

Ziehen Sie dann die Spritze langsam zurück, um das DPBS herauszuziehen. Blasen Sie die Lunge mit demselben DPBS wieder auf und ziehen Sie die Spritze erneut zurück, um die bronchoalveoläre Spülflüssigkeit (BAL) aufzufangen. Trennen Sie die Spritze vom Katheter, während der Katheter eingeführt bleibt.

Geben Sie das gesammelte Ventil in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Füllen Sie anschließend dieselbe Ein-Milliliter-Spritze mit einem Milliliter Dispase. Befestigen Sie die Spritze am Katheter und blasen Sie die Lunge mit Dispase auf.

Während Sie den Katheter entfernen, ziehen Sie die Naht um die Luftröhre fest, um ein Austreten der Dispase zu verhindern. Schneiden Sie mit einer Schere seitlich durch die Luftröhre. Entfernen Sie die Lunge aus der Körperhöhle, indem Sie das Bindegewebe entlang der Rückseite des Brustkorbs durchschneiden, während Sie die Lunge und die Luftröhre nach oben ziehen.

Entferne dann das Herz aus der Lunge. Legen Sie die Lunge in fünf Milliliter DPBS auf Eis. Zentrifugenventil bei 400 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.

Saugen Sie mit einer Pipette den Überstand ab und resuspendieren Sie das Pellet in 100 Mikrolitern RPMI. Zu Beginn präparieren Sie die fünf Lungenlappen, die der Maus entnommen wurden, und entsorgen Sie das Bindegewebe. Zerkleinern Sie das präparierte Lungengewebe mit einer Schere eine Minute lang auf einem Objektträger.

Übertragen Sie das gehackte Lungengewebe mit einer Präparierschere in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie dann drei Milliliter Aufschlussmischung hinzu und pipettieren Sie die Lungenverdaumischung zwei- bis dreimal auf und ab. Fügen Sie abschließend das aus BAL gewonnene Zellpellet hinzu, das in RPMI resuspendiert wurde.

Platzieren Sie das Rohr in einem 45-Grad-Winkel in einem Orbitalschüttler, der auf 140 U/min bei 37 Grad Celsius für 40 Minuten eingestellt ist. Nach der Inkubation das Röhrchen aus dem Shaker nehmen und auf Eis legen. Pipettieren Sie das Lungenverdaugemisch fünf- bis sechsmal auf und ab.

Filtrieren Sie die Mischung durch ein 70-Mikrometer-Zellensieb in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen. Waschen Sie alle verbleibenden Zellen durch den Filter und neutralisieren Sie die Enzyme mit 10 Millilitern 5%FBS im RPMI-Medium. Die Probe wird bei 600 g fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius zentrifugiert.

Der Überstand wird mit einem Vakuumsauger abgesaugt. Resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Milliliter ACK-Lysepuffer und inkubieren Sie es drei Minuten lang bei Raumtemperatur, um die roten Blutkörperchen zu lysieren. Fügen Sie dann neun Milliliter PBS hinzu und pipettieren Sie auf und ab, um die Lösung zu mischen.

Zentrifugieren Sie die Probe erneut und verwenden Sie einen Vakuumsauger, um den Überstand zu entfernen, und resuspendieren Sie dann das Zellpellet in einem Milliliter fluoreszenzaktiviertem Zellsortierpuffer. Filtrieren Sie die Suspension durch ein 64-Mikrometer-Netz in ein Mikrozentrifugenröhrchen für die Durchflusszytometrie-Analyse.