Tröpfchenbasierter Zytotoxizitätsassay zur Beurteilung von chimären Antigenrezeptor-T-Zellen auf Einzelzellebene

Unsere Forschung konzentriert sich auf die Bewertung der funktionellen Diversität von CAR-T-Zellen durch Verkapselung von CAR-T-Zellen mit einzelnen Effektoren mit Zielzellen, um ihr zytotoxisches Potenzial auf Einzelzellebene besser zu verstehen. Die derzeitigen Zytotoxizitätstests sind begrenzt, da sie oft in großen Mengen durchgeführt werden. Dabei werden Unterschiede zwischen einzelnen CAR-T-Zellen übersehen und es gelingt nicht, unterschiedliche Subpopulationen mit unterschiedlichen Reaktionen auf Ziele zu identifizieren.

Unsere Technologie ermöglicht Multiplex-Zelltötungsassays in einem Einzelzellformat unter Verwendung von Standard-Durchflusszytometern und Zellordnungen. Dies führt zu präziseren Ergebnissen als bei Massenprotokollen, da es keine Interferenzen durch benachbarte Zellen gibt. Wir hoffen, dass diese Art von Forschung es uns und anderen Wissenschaftlern ermöglichen wird, die feineren Details unserer CARs und ihre Funktionsweise auf Einzelzellebene besser zu untersuchen.

Zu Beginn verdünnen Sie Stammlösungen von zwei Fluoreszenzfarbstoffen im Verhältnis 1:5.000 in Dulbeccos PBS. Übertragen Sie die Zellen in separate 15-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 300 g fünf Minuten lang.

Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Effektorzellenpellets in der Arbeitslösung des violetten Fluoreszenzfarbstoffs. Resuspendieren Sie die Zielzellpellets in der Arbeitslösung des dunkelroten Fluoreszenzfarbstoffs. Inkubieren Sie die gefärbten Zellen 20 Minuten lang in einem 37 Grad Celsius befeuchteten Kohlendioxid-Inkubator.

Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 300 g, um sie zu pelletieren. Resuspendieren Sie die Zellpellets in 15 Millilitern vollständigem RPMI 1640 Medium, um sie zu waschen. Waschen und erneut zentrifugieren.

Entfernen Sie dann den Überstand und resuspendieren Sie die Effektorzellenpellets in 225 Mikrolitern des vollständigen RPMI 1640-Mediums und die Zielzellenpellets in 450 Mikrolitern desselben Mediums. Geben Sie 30 Mikroliter eines Gradientenmediums zu den Effektorzellsuspensionen und 60 Mikroliter zu den Zielzellsuspensionen. Mischen Sie die Gradientenmedium-Stammlösung vor dem Pipettieren gut.

Anschließend verdünnen Sie das Granzyme B-Substrat mit vollständigem RPMI 1640-Medium. Pipettieren Sie die Peridiumiodid-Stammlösung und das verdünnte Granzym-B-Substrat in die Effektorzellsuspensionen und Zielzellsuspensionen. Dann pipettieren, um die Lösungen gut zu mischen.

Um die Zellen zu verkapseln, heizen Sie die Verkapselungspatrone und die Stabilisierungslösung auf Raumtemperatur vor. Fügen Sie das komplette RPMI 1640 Medium mit 33 % stabilisierender Lösung für Zellen und 10 % Gradientenmedium hinzu. Und mischen Sie sie, um einen Vorrat an äußerem Medium vorzubereiten.

Mischen Sie für jede Verkapselungsprobe 65 Mikroliter der vorbereiteten Effektorzellsuspension mit 65 Mikrolitern der vorbereiteten Zielzellsuspension in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen. Resuspendieren Sie die Zellen gut mit einer Pipette. Beladen Sie die angegebenen Vertiefungen der Verkapselungspatrone mit Reagenzien in der angegebenen Reihenfolge.

Reese suspendiert die Zellen kurz vor dem Laden gut mit einer Pipette. Verschließen Sie die Dichtung vorsichtig auf der Kartusche. Übertragen Sie die Kartusche auf das Mikrofluidikgerät und starten Sie dann die Verkapselung gemäß der Bedienungsanleitung.

Entfernen Sie nach Abschluss des Laufs die Kartusche und ernten Sie die Tröpfchen aus Vertiefung D, indem Sie sie in dem überlagernden Medium resuspendieren und in ein zwei Milliliter DNA-Röhrchen mit niedriger Bindung mit Deckel überführen. Waschen Sie Vertiefung D mit dem restlichen äußeren Medium aus Vertiefung A, um die restlichen Tröpfchen aufzufangen. Wenn sich die Tröpfchen in den Sammelröhrchen abgesetzt haben, bestätigen Sie vor der mikroskopischen Untersuchung zwei deutlich voneinander entfernte Phasen in den Röhrchen.

Füllen Sie etwa ein Drittel einer 10-Mikroliter-Pipettenspitze mit Tröpfchen von der Oberfläche der Tröpfchenschicht. Füllen Sie dann die restlichen ca. zwei Drittel der Pipettenspitze mit dem überlagernden Medium auf. Laden Sie die Probe sofort auf einen Objektträger mit acht Kammern.

Untersuchen Sie die Tröpfchen mikroskopisch bei 4- und 20-facher Vergrößerung, um die Tröpfchenbeladung mit den Zellen zu bestätigen. Verwenden Sie für die Inkubation eine 21-Gauge-Spritzennadel, um den Deckel der erforderlichen Anzahl von zwei Millilitern DNA-Röhrchen mit niedriger Bindung vorsichtig zu durchstechen. Geben Sie einen Milliliter äußeres Medium in jedes Inkubationsröhrchen.

Die in den überlagernden Medien erzeugten Tröpfchen werden resuspendiert und jede Produktion in drei vorbereitete Inkubationsröhrchen aufgeteilt. Legen Sie die Röhrchen nach der Tröpfchenerzeugung für zwei, vier oder sechs Stunden aufrecht in den Inkubator. Übertragen Sie nach der Inkubation eine kleine Anzahl von Tröpfchen auf einen Objektträger.

Analysieren Sie die Tröpfchen durch Hellfeld- und Fluoreszenzmikroskopie mit einem Standard-Fluoreszenzmikroskop mit geeigneter Laser- und Filterkonfiguration. Resuspendieren Sie jede Tröpfchenprobe im überlagernden Medium. Die resuspendierten Proben werden in fünf Milliliter FAC-Röhrchen überführt.

Analysieren Sie die Tröpfchen mit einem Standard-Durchflusszytometer. Aufzeichnung von Intensitätshöhensignalen für Vorwärtsstreuung, Seitenstreuung und die untersuchten Fluorophore. Waschen Sie das Durchflusszytometer durch die Probeninjektionsöffnung Nach jedem Satz von Tröpfchenaufnahmen mit Standard-Reinigungs- und Spüllösungen.

CAR-T-Zellen wurden erfolgreich auf eine Reinheit von über 98% für beide Spender mit anti-NGFR-Magnetbeads angereichert und ihr CD4-CD8-Verhältnis wurde mit 0,73 quantifiziert, wobei ein naiver Gedächtnisphänotyp beobachtet wurde. Nicht transduzierte T-Zellen wurden als Kontrollen im Experiment verwendet. Die Fluoreszenzmikroskopie nach vierstündiger Inkubation zeigte eine Granzym-B-Sekretion in Tröpfchen mit JeKo-1-Zellen, die mit CAR-T-Zellen verkapselt waren, während bei nicht transduzierten T-Zellen keine Sekretion nachgewiesen wurde.

Die Durchflusszytometrie identifizierte unterschiedliche Tröpfchenpopulationen basierend auf den verkapselten Zelltypen und bestätigte, dass eine ausgeprägte Granzym-B-Sekretion und zytotoxische Aktivität in Tröpfchen auftrat, die CAR-T-Zellen und JeKo-1-Zielzellen enthielten. Die Sekretion von Granzym-B-Zellen und die Abtötung von Zielzellen durch CAR-T-Zellen zeigten einen zeitabhängigen Anstieg, wobei mehr als 30 % der CAR-T-Zellen nach sechs Stunden Granzym B sezernierten und mehr als 20 % der CAR-T-Zellen Zielzellen töteten, was durch die Propidiumiodid-Positivität angezeigt wird.