Verbesserte Methodik für die Flüssigkeitsabgabe in die Lunge der Maus: Intubation mit einem Consumer-Otoskop

[Ansager] Verbesserte Methodik für die Flüssigkeitsabgabe an die Lunge von Mäusen. Intubation mit einem Consumer-Otoskop. Alle tierexperimentellen Verfahren und dieser Inhalt wurden von der Abteilung für Vergleichende Medizin der Tulane University überprüft und sind gemäß Protokoll 1810 genehmigt. Holen Sie die Genehmigung der IACUC ein und konsultieren Sie das Veterinärpersonal Ihrer Einrichtung, bevor Sie fortfahren. Die Entwicklung neuer Lungentherapeutika hängt von einer zuverlässigen, wiederholbaren Verabreichung an die Lunge der Maus ab, stützt sich jedoch traditionell auf die intranasale Verabreichung, die oropharyngeale Aspiration durch volle Zunge oder den chirurgischen Cutdown. Die folgende Methode hat die Variabilität im Vergleich zur vollen Zunge reduziert, so dass kleinere Tierkohorten möglich sind. Es ist auch weitaus weniger invasiv als Cutdown. Verfahren, Schritt eins, Einrichtung. Das Nagetier-Intubationskit verwendete ursprünglich Schiffe mit Intubationssicherheitskeilen. Dabei handelt es sich um kleine konische Hülsen, die über einen flexiblen Katheter von 20 Gauge und einem Zoll passen. Sie verhindern, dass der Katheter die Carina beschädigt. Reinigen Sie einen Sicherheitskeil mit einem Isopropanol-Vorbereitungspad, bevor Sie ihn verwenden. Schieben Sie den sauberen Sicherheitskeil, hier grün, auf die flexible Kanüle mit 20 Gauge. Sammeln Sie die anderen benötigten Werkzeuge, einschließlich eines handelsüblichen Otoskops, eines Mobiltelefons, eines Mausständers mit Nasenkonus, einer gebogenen, fein gezackten Pinzette, des Endotrachealtubus und des faseroptischen Lichts, falls verwendet. Reinigen Sie all diese vor dem Gebrauch mit einem Isopropanol-Vorbereitungspad. Nehmen Sie einen etwa 20 Zentimeter langen flexiblen Schlauch. Biegen Sie es in eine U-Form und fügen Sie an einem Ende eine Köderschlossverbindung hinzu. Befestigen Sie die U-Form mit einem Drehbinder. Geben Sie zwei bis 300 Mikroliter steril gefiltertes Wasser oder Tusche in die Tube. Im Folgenden wird diese Anordnung als Blasenrohr bezeichnet. Nehmen Sie eine Nahtschlaufe, indem Sie 13 Zentimeter Seidennaht der Größe Null in einen Kreis binden. Platzieren Sie diese Schlaufe oben am Mausständer und stellen Sie sicher, dass beide Seiten der Naht gut gesichert sind. Platzieren Sie den Mausständer auf der Metallbasis für Lupenlicht. Positionieren Sie die helfenden Hände an der Stelle, an der sich der Mund der Maus befinden wird. Platzieren Sie eine Maus in der Induktionskammer. Verwenden Sie Sauerstoff mit konstanter Durchflussrate von 0,8 Litern pro Minute und 2 % Isofluran. Betäuben Sie die Maus ausreichend, damit sie während des Platzierens des Nasenkegels nicht aufwacht. Unterdrücken Sie die Atemfrequenz der Maus nicht signifikant. Regelmäßige Atemzüge helfen bei der Wertschätzung der Stimmlippen. Verbinden Sie das Otoskop mit dem Mobiltelefon und stellen Sie sicher, dass der Video-Feed stabil ist. Um die Isofluorbelastung des Forschers während dieses Verfahrens zu minimieren, verwenden Sie ein chemisches Atemschutzgerät, wenn Sie mehrere Intubationen durchführen oder in dieser Methode geschult werden. Alternativ können Sie den Eingriff in ein paar Hölzern durchführen. Schritt zwei, Tierinszenierung. Nehmen Sie das erste Tier aus der Induktionskammer, sobald es schläft. Zerkleinern Sie sie und platzieren Sie ihre oberen Zähne auf der Länge der Naht. Üben Sie leichte Spannung auf das Tier aus, um die Positionierung der Naht beizubehalten, während Sie die Maus wieder auf den Ständer legen. Stellen Sie den Halswinkel leicht nach hinten ein und platzieren Sie den Hals in einer kleinen Streckung von fünf bis 15 Grad. Schieben Sie den Nasenkegel vorsichtig über die Nasenlöcher. Drücken Sie den Nasenkegel nicht fest nach unten, da dies die Naht beeinträchtigen kann, an der die Maus hängt. Fassen Sie die Zunge mit einer großen, fein gezackten, gebogenen Pinzette so fest wie möglich an der Unterlippe. Ziehen Sie es fest nach unten und weg von den oberen Zähnen und hinüber zur Seite der unteren Zähne. Vorsicht, langes Tressen, übermäßige Spannung oder das Zerquetschen der Zunge können die Gesundheit der Tiere beeinträchtigen. Bitte achten Sie auf Anzeichen eines Traumas wie Blutergüsse, Blutungen, Schwellungen oder Austrocknung der Zunge. Falls solche beobachtet werden, brechen Sie den Eingriff ab und alarmieren Sie das Tierarztpersonal. Wenn Sie helfende Hände verwenden, stützen Sie die Pinzette in dieser Position ab. Führen Sie das faseroptische Licht bei Verwendung durch den flexiblen Katheter und den Intubationssicherheitskeil an Ort und Stelle. Schritt drei, die visuelle Wertschätzung der Stimmbänder und der Intubation. Mit dem Otoskop in der nicht dominanten Hand drücken Sie leicht auf die Zunge. Winkeln Sie dann die Kamera und ihre Lichtquelle an, um die Stimmbänder in der Nähe des Zungenansatzes zu visualisieren. Aufgrund geringfügiger Variationen in der Anatomie und Gewebefarbe verwenden Sie die Bewegung, die mit der Atmung verbunden ist, um die strukturelle Identifizierung zu bestätigen. Zu Beginn kann es schwierig sein, sich im Video-Feed zu orientieren. Das sind die falschen Stimmlippen. Das sind die wahren Stimmbänder. Dies ist eine Reflexion vom bukkalen Gewebe. Dies ist die Sonde und das faseroptische Licht. Das ist die Epiglottis. Das ist der weiche Gaumen. Dies ist die Rima glottidis, Ihr Ziel für die Intubation. Dies ist die Otoskop-Lippe, die die Zunge niederdrückt. Das ist die No-Go-Region. Führen Sie die Kanüle bei eingeschaltetem faseroptischem Licht neben das Otoskop und halten Sie leichten Kontakt mit der Basis der Zunge oder dem Lippenteil des Otoskops. Stellen Sie als Referenz den Annäherungswinkel für den Katheter so ein, dass er sehr flach ist. Unmittelbar nach dem Einführen des Katheters heben Sie die Spitze des Katheters weniger als einen Millimeter hinter den Stimmlippen an, so dass sie fast parallel zur Tischplatte ist. Dadurch wird verhindert, dass der Epiglottis den Katheter dorsal in die Speiseröhre drückt. Beachten Sie, dass es beim Vorschieben des Katheters fast keinen Widerstand geben sollte. Wenn Sie auf Widerstand stoßen, entfernen Sie sofort den Katheter und lassen Sie die Atmung wieder normal werden. Wenn Blutungen beobachtet werden, wenden Sie sich an das Tierarztpersonal. Schritt vier, Bestätigung der Platzierung des Endotrachealtubus. Neben der visuellen Bestätigung, dass sich der Schlauch an der richtigen Stelle befindet, mit dem Otoskop bietet die Luftröhre während der Platzierung einen geringeren Widerstand als die Speiseröhre. Die optische Einstichtiefe beträgt etwa fünf Millimeter hinter den Stimmlippen. Das Licht kann durch den Hals gesehen werden, um zu bestätigen, dass die Einführtiefe angemessen ist. Beachten Sie, dass der Intubationssicherheitskeil eine übermäßige Tiefe bei der Platzierung des Endotrachealtubus verhindern sollte. Der Sicherheitskeil verhindert ein Trauma der Corina, muss aber nicht das Vorschieben verhindern. Halten Sie dann den Endotrachealtubus fest und entfernen Sie das faseroptische Licht. Bestätigen Sie die korrekte Platzierung des Katheters mit der Blasenschlauchmethode. Befestigen Sie das Blasenrohr mit der unteren Verriegelung. Das Tidalvolumen sollte sofort ersichtlich sein. Ist dies nicht der Fall, ist der Endotrachealtubus falsch platziert. Entfernen Sie es schnell und lassen Sie die normale Atemfrequenz der Maus zurückkehren. Schritt fünf, die intratracheale Verabreichung. Ähnlich wie bei der Zungenzugmethode für die oropharyngeale Entbindung besteht bei der Entbindung durch Intubation die Gefahr, dass das Tier ertränkt wird. Bei jugendlichen und erwachsenen Mäusen sind 50 Mikroliter ein im Allgemeinen sicheres Volumen an Flüssigkeit und ausreichend, um sich in der Lunge zu verteilen. Wenn Sie eine Pipette zur Verabreichung verwenden, pipettieren Sie das gewünschte Volumen direkt in den Katheter und lassen Sie die Maus die Lösung inhalieren. Um eine diffuse Abgabe an die Lunge zu gewährleisten, plus die abgegebene Flüssigkeit in die Lunge mit bis zu 500 Mikrolitern Luft. Falls gewünscht, können mehrere Vertiefungen des Pipettensystems durchgeführt werden, ohne eine negative Aspiration der zugeführten Flüssigkeit zu riskieren. Beachten Sie, dass bei der Spülung des Inokulums mit Luft die Verwendung von mehr als dem Atemzugvolumen, etwa 200 Mikroliter, erforderlich sein kann. Die Verwendung von 500 Mikrolitern birgt jedoch kein Traumarisiko, da es nur etwa die Hälfte der vitalen Kapazität ist. Schritt sechs, Bewertung der Lieferung. Eine tragbare faseroptische Leuchte kann aus billigen und leicht zu beschaffenden Komponenten hergestellt werden. Eine kommerzielle Glasfaseranordnung, wie hier gezeigt, kann verwendet werden. Es genügt jedoch ein konischer 50-ml-Röhrchendeckel, in den mit einer 20-Gauge-Nadel ein Loch gestanzt wird, durch das ein 0,75 Millimeter langes Kunststoff-Glasfaserkabel geführt wird. In diesem Video wurden sowohl kommerzielle als auch handgefertigte Geräte verwendet. Repräsentative Ergebnisse: Die intratracheale Verabreichung mittels Intubation führt zu einer verbesserten Entbindung und einer geringeren Variabilität im Vergleich zur oropharyngealen Aspiration durch Zungenzug. Direkter Vergleich von Zungenzug und geführter Intubation. Drei verschiedene Untersucher mit vergrabener Erfahrung oder gebeten, unabhängig voneinander 50 Mikroliter verdünnte Tusche oropharyngeal durch Zungenziehen an 10 bis 12 Wochen alte C57 BL/6J-Mäuse beiderlei Geschlechts zu verabreichen. Zwei Forscher gaben auch den gleichen Vorrat und die gleiche Menge an Tinte per Intubation an die Lunge ab wie beschrieben. Die Lunge wurde kurz nach der Entbindung entnommen und unter 2-facher Vergrößerung fotografiert. Die Fotos wurden von einem unabhängigen verblindeten Forscher unter Verwendung von Bild J auf den Bereich untersucht, der gefärbt wurde. Sie stellte fest, dass mehr Lungenbereich verfärbt war, wenn eine Intubation verwendet wurde. Darüber hinaus wurde die Variabilität, ausgedrückt als prozentuale Abweichung vom Mittelwert, reduziert, wenn die intratracheale Verabreichung nach Intubation anstelle des Zungenziehens verwendet wurde. Diese Station, die für die geführte Intubation verwendet wird, ist wie gezeigt vorbereitet. Von links: Pipetten für die Entbindung, Sprudelschlauch zur Bestätigung der korrekten Platzierung des Endotrachealtubus, Pinzette, Spatel, pädiatrisches Nasenspekulum, helfende Hände, Lupenlicht, Mausständer mit Nasenkonus, faseroptische Sonde und Anästhesie-Induktionskammer. Die Intubation führt zu einer besseren Abgabe an die Lunge mit geringerer Variabilität im Vergleich zur OP-Aspiration. 10 Wochen alte weibliche Klappe C-Mäuse wurden mit einer Dosis von 10 mal 10 bis zur 11. VG AIV 6.2 Luciferase dosiert und sieben Tage später mit in vivo biolumineszierender Bildgebung untersucht. 10 Minuten vor der Bildgebung wurde ihnen subkutan Luciferin injiziert. Gezeigt werden repräsentative A-vis-Bilder von Mäusen, die AV 6.2 Luziferase durch OP-Aspiration nach Zungenziehen oder intratracheale Installation durch Intubation erhielten. Die oropharyngeale Aspiration durch Zungenzug führte zu einer Verteilung des Signals in verschiedenen Teilen der oberen Atemwege, während die Intubation zu einem konzentrierten Signal in der Lunge führte. Die interessierenden Bereiche sind derselbe Bereich, und die durchschnittliche Strahldichte innerhalb des Bereichs wird auf dem Bild angezeigt. Die Quantifizierung der Luciferase-Signale zeigte eine verbesserte Verabreichungseffizienz an die Lunge durch Intubation und unterstreicht die reduzierte Variabilität bei der Verabreichung mit dieser Methode. Schlussfolgerung: Wie in den vorherigen Abbildungen zu sehen ist, zeigt die interpulmonale Inokulation mit der traditionellen Zungenzugmethode eine lückenhafte, inkonsistente Inokulumverteilung und eine größere Variabilität in der Menge, die die Lunge erreicht. Im Gegensatz dazu führte die Intubationsmethode zu einer konsistenteren Verabreichung sowohl in die rechte als auch in die linke Lunge und war weniger variabel. Die nachweislich positiven Ergebnisse dieser Intubationsmethode sind erstens die replizierbare Installation von bis zu 50 Mikrolitern in der Lunge der Maus, zweitens die diffuse Verteilung der eingeträufelten Flüssigkeit in der Lunge und drittens die reduzierte Ausbreitung des Inokulums über die Lunge hinaus. Diese Methode ist schnell, sicher und kann ohne kostspielige Geräte oder zeitintensive Schulungen in Laborverfahren integriert werden.