Name: Trennung und Fraktionierung von Kulturfiltratproteinen (CFPs) aus Mycobacterium tuberculosis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-11T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Erfahren Sie die Trennung von Kulturfiltratproteinen aus Mycobacterium tuberculosis mittels isoelektrischer Fokussierung und SDS-PAGE. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung immunogener Proteinfraktionen für Diagnostik und Impfstoffentwicklung.

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<ol><li>Gomez, M., Johnson, S., Gennaro, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+secreted+proteins+of+Mycobacterium+tuberculosis+by+a+bioinformatic+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Identification of secreted proteins of Mycobacterium tuberculosis by a bioinformatic approach.</a> Infect Immun. 68 (4), 2323-2327 (2000).</li>
<li>de Souza, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-accuracy+mass+spectrometry+analysis+as+a+tool+to+verify+and+improve+gene+annotation+using+Mycobacterium+tuberculosis+as+an+example%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">High-accuracy mass spectrometry analysis as a tool to verify and improve gene annotation using Mycobacterium tuberculosis as an example.</a> BMC Genomics. 9, 316(2008).</li>
<li>Lim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+new+T-cell-stimulating+antigens+from+Mycobacterium+tuberculosis+culture+filtrate%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Identification of the new T-cell-stimulating antigens from Mycobacterium tuberculosis culture filtrate.</a> FEMS Microbiol Lett. 232 (1), 51-59 (2004).</li>
<li>Covert, B. A., Spencer, J. S., Orme, I. M., Belisle, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+proteomics+in+defining+the+T+cell+antigens+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">The application of proteomics in defining the T cell antigens of Mycobacterium tuberculosis.</a> Proteomics. 1 (5), 574-586 (2001).</li>
<li>Tucci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+proteomic+and+glycoproteomic+profiling+of+Mycobacterium+tuberculosis+culture+filtrate%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Integrative proteomic and glycoproteomic profiling of Mycobacterium tuberculosis culture filtrate.</a> PLoS One. 15 (3), e0221837(2020).</li>
<li>Deenadayalan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoproteomic+identification+of+human+T+cell+antigens+of+Mycobacterium+tuberculosis+that+differentiate+healthy+contacts+from+tuberculosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Immunoproteomic identification of human T cell antigens of Mycobacterium tuberculosis that differentiate healthy contacts from tuberculosis patients.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (3), 538-549 (2010).</li>
<li>Yasuda, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+cytokine+profiles+related+to+Mycobacterium+tuberculosis+latent+antigens+using+a+whole-blood+assay+in+the+Philippines%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of cytokine profiles related to Mycobacterium tuberculosis latent antigens using a whole-blood assay in the Philippines.</a> Front Immunol. 15, 1330796(2024).</li>
<li>Målen, H., Søfteland, T., Wiker, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+analysis+of+Mycobacterium+tuberculosis+H37Rv+culture+filtrate+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen analysis of Mycobacterium tuberculosis H37Rv culture filtrate proteins.</a> Scand J Immunol. 67 (3), 245-252 (2008).</li>
<li>Bekmurzayeva, A., Sypabekova, M., Kanayeva, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuberculosis+diagnosis+using+immunodominant%2C+secreted+antigens+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis+%28Edinb%29%22%5BJournal%5D)">Tuberculosis diagnosis using immunodominant, secreted antigens of Mycobacterium tuberculosis.</a> Tuberculosis (Edinb). 93 (4), 381-388 (2013).</li>
<li>Rodríguez-Hernández, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+antigenic+biomarkers+for+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Zhejiang+Univ+Sci+B%22%5BJournal%5D)">Application of antigenic biomarkers for Mycobacterium tuberculosis.</a> J Zhejiang Univ Sci B. 21 (11), 856-870 (2020).</li>
<li>Mustafa, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+biological+characterization+of+Mycobacterium+tuberculosis-specific+ESAT6-like+proteins+and+their+potentials+in+the+prevention+of+tuberculosis+and+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Princ+Pract%22%5BJournal%5D)">Chemical and biological characterization of Mycobacterium tuberculosis-specific ESAT6-like proteins and their potentials in the prevention of tuberculosis and asthma.</a> Med Princ Pract. 32 (4-5), 217-224 (2023).</li>
<li>Rosenkrands, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+the+proteome+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Towards the proteome of Mycobacterium tuberculosis.</a> Electrophoresis. 21 (17), 3740-3756 (2000).</li>
<li>Jungblut, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+proteome+analysis+of+Mycobacterium+tuberculosis+and+Mycobacterium+bovis+BCG+strains%3A+Towards+functional+genomics+of+microbial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparative proteome analysis of Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis BCG strains: Towards functional genomics of microbial pathogens.</a> Mol Microbiol. 33 (6), 1103-1117 (1999).</li>
<li>Lim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+new+T-cell-stimulating+antigens+from+Mycobacterium+tuberculosis+culture+filtrate%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Identification of the new T-cell-stimulating antigens from Mycobacterium tuberculosis culture filtrate.</a> FEMS Microbiol Lett. 232 (1), 51-59 (2004).</li>
<li>Rodríguez-Hernández, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+antigenic+biomarkers+for+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Zhejiang+Univ+Sci+B%22%5BJournal%5D)">Application of antigenic biomarkers for Mycobacterium tuberculosis.</a> J Zhejiang Univ Sci B. 21 (11), 856-870 (2020).</li>
<li>Deenadayalan, A., Sundaramurthi, J. C., Raja, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+and+proteomic+analysis+of+preparative+isoelectric-focusing+separated+culture+filtrate+antigens+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Immunological and proteomic analysis of preparative isoelectric-focusing separated culture filtrate antigens of Mycobacterium tuberculosis.</a> Exp Mol Pathol. 88 (1), 156-162 (2010).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>&Auml; KTA Flussmittel-Tangentialfluss-Filtersystem&nbsp;</td><td>CYTIVA</td><td>29038437</td><td></td></tr><tr><td>Ampholyte (pH 3,0 bis 10,0 )</td><td>BIO-RAD</td><td>1632094</td><td></td></tr><tr><td>Ampholyte (pH 4,0 bis 6,0 )</td><td>BIO-RAD</td><td>1631143</td><td></td></tr><tr><td>BCA-Protein-Assay&nbsp;</td><td>MERCK</td><td>71285-M</td><td></td></tr><tr><td>MÜTZEN</td><td>MERCK</td><td>Nr. C2632</td><td></td></tr><tr><td>Kaseinhydrolysat</td><td>MERCK</td><td>65072-00-6</td><td></td></tr><tr><td>Zitronensäure</td><td>MERCK</td><td>Nr. C0759</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>MERCK</td><td>300410</td><td></td></tr><tr><td>DVB-T</td><td>MERCK</td><td>Nr. D9779</td><td></td></tr><tr><td>Eisen(III)-Ammoniumsulfat</td><td>HIMEDIA</td><td>GRM10944</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>MERCK</td><td>Nr. G5516</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin&nbsp;</td><td>MERCK</td><td>252859</td><td></td></tr><tr><td>Löwenstein-Jensen neigt sich&nbsp;</td><td>HIMEDIA</td><td>Nr. SL001</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat</td><td>MERCK</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Millipore Stericup Schnellwechsel-Vakuumfiltrationssystem</td><td>MERCK</td><td>S2HVU11RE</td><td></td></tr><tr><td>Phosphorsäure&nbsp;</td><td>MERCK</td><td>695017</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumdihydrogenorthophosphat</td><td>MERCK</td><td>Nr. P0662</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumhydroxid&nbsp;</td><td>MERCK</td><td>484016</td><td></td></tr><tr><td>Präparative IEF-Zelle (Rotofor)&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>170-2986&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazid&nbsp;</td><td>MERCK</td><td>Nr. 2002</td><td></td></tr><tr><td>Natriumglutamat</td><td>MERCK</td><td>49621</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>HIMEDIA</td><td>Nr. MB095</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>MERCK</td><td>252859</td><td></td></tr><tr><td>Harnstoff</td><td>MERCK</td><td>U5128</td><td></td></tr><tr><td>Ganzes Gel Eluter Gerät&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>1651250</td><td></td></tr></tbody></table>

trennung und fraktionierung von kulturfiltratproteinen (cfps) aus mycobacterium tuberculosis

Separation and Fractionation of Culture Filtrate Proteins (CFPs) from Mycobacterium tuberculosis

Abbildung 1 veranschaulicht die Komplexität der hergestellten Kulturfiltratproteine (CFP). Zunächst wurden 100 μg CFP einer 2D-SDS-PAGE-Analyse unterzogen, um die Komplexität zu bewerten. Diese Analyse ergab das Vorhandensein von fast 100 verschiedenen Proteinflecken in der CFP (Abbildung 1).
Die 20 Fraktionen, die bei jedem Lauf gesammelt wurden, wurden mit SDS-PAGE analysiert. Davon sind drei repräsentative Fraktionen aus drei versc...

Trennung und Fraktionierung von Kulturfiltratproteinen (CFPs) aus Mycobacterium tuberculosis

Secreted proteins of Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) play a crucial role in tuberculosis pathogenesis, immune modulation, and disease ...

separation-fractionation-culture-filtrate-proteins-cfps-from

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Quelle: Gupta, S., Marcela Rodriguez, G. Isolierung und Charakterisierung extrazellulärer Vesikel, die von eisenbegrenzten Mykobakterien produziert werden. J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video zeigt die schrittweise Isolierung von extrazellulären Vesikeln (EVs) aus Mycobacterium tuberculosis , die unter eisenlimitierenden Bedingungen kultiviert wurden, die die Wirtsumgebung nachahmen. Es wird der Einsatz von Ultrafiltration, Differenzialzentrifugation und Dichtegradiententrennung zur Anreicherung...

Isolierung von siderophorhaltigen extrazellulären Vesikeln aus Mycobacterium tuberculosis

Dieses Video demonstriert die auf Dünnschichtchromatographie basierende Trennung von Mykolsäuren. Bei dieser Technik werden die verschiedenen Mykolsäuren – langkettige Lipide, die in der Zellwand von Mykobakterien vorkommen – anhand ihrer Polarität getrennt.

Dünnschichtchromatographie-basierte Trennung von Mykolsäurevarianten: Eine Methode zur Trennung von mykobakteriellen Zellwandlipiden anhand der Polarität

Dieses Video zeigt die Isolierung und Konzentration von Bakterienkulturfiltratproteinen, zu denen auch bakterielle extrazelluläre Vesikel gehören, mittels Ultrafiltration. Die konzentrierten extrazellulären Vesikel dienen als diagnostische Marker für die Krankheitserkennung.

Filtratproteinkonzentration in Bakterienkulturen mit einem Ultrafiltrationsgerät

Dieses Video zeigt die Größenausschlusschromatographie (SEC) Technik zur Reinigung bakterieller extrazellulärer Vesikel (EVs) aus dem Kulturfiltrat von Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Bei der Technik wird eine poröse, mit Harz gefüllte Säule verwendet, um gereinigte Fraktionen von EVs zu erhalten. Die porösen Partikel lassen selektiv kleinere Proteine in die Poren eindringen, was zu einer langsameren Elution führt. Gleichzeitig werden EVs aufgrund ihrer größeren Größe vom Eindringen in die...

Eine Größenausschlusschromatographie-Technik zur Reinigung mykobakterieller extrazellulärer Vesikel

Ziel ist es, bioaktive kleine Moleküle, Peptide aus einem komplexen Pflanzenextrakt und Proteine aus pathogenen Mikroben durch die Anwendung der Flüssigphasen-Isotonisierungsmethode (IEF) zu fraktionieren und zu isolieren. Darüber hinaus wurden die getrennten Moleküle identifiziert und ihre Bioaktivität bestätigt.

Trennung von bioaktiven kleinen Molekülen, Peptiden aus natürlichen Quellen und Proteinen aus Mikroben durch Präparative Isoelektrische Fokussierung (IEF) Methode

Eine schnelle und effiziente Quantifizierung des intrazellulären M . tuberculosis-Wachstums ist entscheidend für verbesserte Therapien gegen Tuberkulose (TB). Dieses Protokoll beschreibt einen brühebasierten kolorimetrischen Detektionsassay unter Verwendung eines automatisierten Flüssigkultursystems zur Quantifizierung des Mtb-Wachstums in Makrophagen, die mit Wirtstherapiekandidaten behandelt werden.

Ein automatisiertes Kultursystem zur präklinischen Erprobung wirtsgerichteter Therapien für Tuberkulose

Bakterien sezernieren nanometergroße extrazelluläre Vesikel (EVs), die bioaktive biologische Moleküle tragen. Die EV-Forschung konzentriert sich auf das Verständnis ihrer Biogenese, ihrer Rolle bei Mikroben-Mikroben- und Wirt-Mikroben-Interaktionen und Krankheiten sowie ihrer potenziellen therapeutischen Anwendungen. Ein Workflow für die skalierbare Isolierung von EVs aus verschiedenen Bakterien wird vorgestellt, um die Standardisierung der EV-Forschung zu erleichtern.

Skalierbare Isolierung und Reinigung extrazellulärer Vesikel aus Escherichia coli und anderen Bakterien

Dieses Protokoll beschreibt die Größenausschlusschromatographie, eine einfache und reproduzierbare Technik zur Anreicherung von Mycobacterium tuberculosis extrazellulären Vesikeln aus Kulturüberständen.

Mycobacterium tuberculosis Extrazelluläre Vesikelanreicherung durch Größenausschlusschromatographie

Dieses Protokoll beschreibt die Anreicherung nativer mykobakterieller extrazellulärer Vesikel (mEVs) aus axenischen Kulturen von Mycobacterium smegmatis (Msm) und wie mCherry (ein rot fluoreszierender Reporter) enthaltende rekombinante MsmEVs entworfen und angereichert werden können. Schließlich wird der neuartige Ansatz mit der Anreicherung von MsmEVs verifiziert, die das EsxA-Protein von Mycobacterium tuberculosis enthalten.

Anreicherung nativer und rekombinanter extrazellulärer Vesikel von Mykobakterien

Hier demonstrieren wir die Herstellung von Mtb-Kulturfiltrat (CF), dem bakteriellen Wachstumsmedium, das aus Proteinen besteht, die von den Bakterien sezerniert werden. Mtb sezerniert Proteine, um die Signalübertragung des Wirts und die Immunantwort zu modulieren, die für die Pathogenese entscheidend sind. Die präparierten CFs werden mittels Massenspektrometrie analysiert, um alle sekretorischen Faktoren zu identifizieren.

Herstellung von Mycobacterium tuberculosis-Kulturfiltrat zum Verständnis der TB-Pathogenese

Dieses Protokoll trennt unlösliche Zellwand- und Membranproteine in einfache Fraktionen (1-5 Proteine) unter Verwendung der präparativen isoelektrischen Fokussierung (IEF) auf der Grundlage des isoelektrischen Punktes, gefolgt von der Trennung nach Molekulargewicht. Die resultierenden Fraktionen können ohne weitere Reinigung direkt für die immunologische und proteomische Analyse verwendet werden.

Trennung und Fraktionierung von Zellwand- und Zellmembranproteinen aus Mycobacterium tuberculosis für die nachgeschaltete Proteinanalytik

Erfahren Sie die Trennung von Kulturfiltratproteinen aus Mycobacterium tuberculosis mittels isoelektrischer Fokussierung und SDS-PAGE. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung immunogener Proteinfraktionen für Diagnostik und Impfstoffentwicklung.

Trennung und Fraktionierung von Kulturfiltratproteinen (CFPs) aus Mycobacterium tuberculosis

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