Name: Trennung und Fraktionierung von Zellwand- und Zellmembranproteinen aus Mycobacterium tuberculosis für die nachgeschaltete Proteinanalytik (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: Lernen Sie die Trennung von Zellwand- und Zellmembranproteinen aus Mycobacterium tuberculosis mittels präparativer isoelektrischer Fokussierung und SDS-PAGE. Diese Methode ermöglicht die direkte Anwendung in proteomischen und immunologischen Assays.

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<ol><li>Seshadri, C., Turner, M. T., Lewinsohn, D. M., Moody, D. B., Van Rhijn, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipoproteins+are+major+targets+of+the+polyclonal+human+T+cell+response+to+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lipoproteins are major targets of the polyclonal human T cell response to Mycobacterium tuberculosis.</a> J Immunol. 190 (1), 278-284 (2013).</li>
<li>Kunnath-Velayudhan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+antibody+responses+to+the+Mycobacterium+tuberculosis+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dynamic antibody responses to the Mycobacterium tuberculosis proteome.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14703-14708 (2010).</li>
<li>Drage, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR2+and+its+co-receptors+determine+responses+of+macrophages+and+dendritic+cells+to+lipoproteins+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">TLR2 and its co-receptors determine responses of macrophages and dendritic cells to lipoproteins of Mycobacterium tuberculosis.</a> Cell Immunol. 258 (1), 29-37 (2009).</li>
<li>Wallin, E., von Heijne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+integral+membrane+proteins+from+eubacterial%2C+archaean%2C+and+eukaryotic+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of integral membrane proteins from eubacterial, archaean, and eukaryotic organisms.</a> Protein Sci. 7, 1029-1038 (1998).</li>
<li>Almeida, J. G., Preto, A. J., Koukos, P. I., Bonvin, A. M. J. J., Moreira, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proteins+structures%3A+A+review+on+computational+modeling+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Membrane proteins structures: A review on computational modeling tools.</a> Biochim Biophys Acta Biomembr. 1859 (10), 2021-2039 (2017).</li>
<li>Finkelstein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structures of membrane proteins.</a> Nature. 511 ((Suppl 7509)), 21(2014).</li>
<li>Smith, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+the+purification+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Strategies for the purification of membrane proteins.</a> Methods Mol Biol. 1485, 389-400 (2017).</li>
<li>Von Jagow, G., Link, T., Schager, H. Purification Strategies for Membrane Proteins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVon+Jagow%2C+G+%22A+Practical+Guide+to+Membrane+Protein+Purification%22">A Practical Guide to Membrane Protein Purification</a>. , Academic Press. San Diego, CA. (1994).</li>
<li>Raja, A., Uma Devi, K. R., Ramalingam, B., Brennan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoglobulin+G%2C+A%2C+and+M+responses+in+serum+and+circulating+immune+complexes+elicited+by+the+16-kilodalton+antigen+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunoglobulin G, A, and M responses in serum and circulating immune complexes elicited by the 16-kilodalton antigen of Mycobacterium tuberculosis.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 9 (2), 308-312 (2002).</li>
<li>Covert, B. A., Spencer, J. S., Orme, I. M., Belisle, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+proteomics+in+defining+the+T+cell+antigens+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">The application of proteomics in defining the T cell antigens of Mycobacterium tuberculosis.</a> Proteomics. 1 (4), 574-586 (2001).</li>
<li>Deenadayalan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoproteomic+identification+of+human+T+cell+antigens+of+Mycobacterium+tuberculosis+that+differentiate+healthy+contacts+from+tuberculosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Immunoproteomic identification of human T cell antigens of Mycobacterium tuberculosis that differentiate healthy contacts from tuberculosis patients.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (3), 538-549 (2010).</li>
<li>Sinha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenic+membrane-associated+proteins+of+Mycobacterium+tuberculosis+revealed+by+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Immunogenic membrane-associated proteins of Mycobacterium tuberculosis revealed by proteomics.</a> Microbiology. 151 (7), 2411-2419 (2005).</li>
<li>Deenadayalan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Integrated+approach+for+proteomic+and+immunological+analysis+of+cell+wall+and+cell+membrane+proteins+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Res+Arch%22%5BJournal%5D)">An Integrated approach for proteomic and immunological analysis of cell wall and cell membrane proteins of Mycobacterium tuberculosis.</a> Med Res Arch. 11 (11), (2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>7H9 Brühe&nbsp;</td><td>Himedia&nbsp;</td><td>M198</td><td></td></tr><tr><td>40% Bio-Lyte 3/10 Ampholyte&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>1631113</td><td></td></tr><tr><td>BCA-Protein-Assay&nbsp;</td><td>MERCK</td><td>BCA1</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Lyte 5/7 Ampholyte&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>1631152</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugalkonzentratoren 3 kDa</td><td>MERCK</td><td>Z629456</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin.</td><td>MERCK</td><td>Nr. D141</td><td></td></tr><tr><td>Dnase</td><td>MERCK</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>DVB-T</td><td>MERCK</td><td>Nr. D9779</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>MERCK</td><td>Nr. E9884</td><td></td></tr><tr><td>EGTA (EGTA)</td><td>MERCK</td><td>Nr. E3889</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>MERCK</td><td>Nr. G5516</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>MERCK</td><td>E18</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin A</td><td>MERCK</td><td>Nr. P5318</td><td></td></tr><tr><td>PMSF (Englisch)</td><td>MERCK</td><td>78830</td><td></td></tr><tr><td>Rnase</td><td>MERCK</td><td>10109134001</td><td></td></tr><tr><td>Rotofor&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>170-2986</td><td>&nbsp; isoelektrische Fokussierung (IEF)</td></tr><tr><td>Ultraschallgerät</td><td>Vibra-Zelle, Sonics</td><td>VC 750</td><td></td></tr><tr><td>TLCK</td><td>MERCK</td><td>Nr. T7254</td><td></td></tr><tr><td>TPCK</td><td>MERCK</td><td>4376</td><td></td></tr><tr><td>Harnstoff</td><td>MERCK</td><td>Nr. U5378</td><td></td></tr><tr><td>Ganzes Gel Eluter Gerät&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>1651250</td><td></td></tr></tbody></table>

trennung und fraktionierung von zellwand- und zellmembranproteinen aus mycobacterium tuberculosis für die nachgeschaltete proteinanalytik

Separation and Fractionation of Cell Wall and Cell Membrane Proteins from Mycobacterium tuberculosis for Downstream Protein Analysis

Isolierung von Zellwand- und Zellmembranproteinen durch Hochgeschwindigkeits-Ultrazentrifugation Zellwand- und Membranproteine wurden aus Ganzzelllysaten mittels Ultrazentrifugation isoliert, wie im Protokoll beschrieben. Die SDS-PAGE-Analyse der abgetrennten subzellulären Fraktionen Zellwand, Zellmembran und Zytosolproteinprofile von M. tuberculosis ist in Abbildung 1 dargestellt.
Trennung von Zellwandproteinen durch präparati...

Trennung und Fraktionierung von Zellwand- und Zellmembranproteinen aus Mycobacterium tuberculosis für die nachgeschaltete Proteinanalytik

Mycobacterium cell wall and membrane proteins, which play a central role in tuberculosis pathogenesis, were successfully separated using preparative ...

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Quelle: Gupta, S., Marcela Rodriguez, G. Isolierung und Charakterisierung extrazellulärer Vesikel, die von eisenbegrenzten Mykobakterien produziert werden. J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video zeigt die schrittweise Isolierung von extrazellulären Vesikeln (EVs) aus Mycobacterium tuberculosis , die unter eisenlimitierenden Bedingungen kultiviert wurden, die die Wirtsumgebung nachahmen. Es wird der Einsatz von Ultrafiltration, Differenzialzentrifugation und Dichtegradiententrennung zur Anreicherung...

Isolierung von siderophorhaltigen extrazellulären Vesikeln aus Mycobacterium tuberculosis

Dieses Video demonstriert die auf Dünnschichtchromatographie basierende Trennung von Mykolsäuren. Bei dieser Technik werden die verschiedenen Mykolsäuren – langkettige Lipide, die in der Zellwand von Mykobakterien vorkommen – anhand ihrer Polarität getrennt.

Dünnschichtchromatographie-basierte Trennung von Mykolsäurevarianten: Eine Methode zur Trennung von mykobakteriellen Zellwandlipiden anhand der Polarität

Dieses Video zeigt die Größenausschlusschromatographie (SEC) Technik zur Reinigung bakterieller extrazellulärer Vesikel (EVs) aus dem Kulturfiltrat von Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Bei der Technik wird eine poröse, mit Harz gefüllte Säule verwendet, um gereinigte Fraktionen von EVs zu erhalten. Die porösen Partikel lassen selektiv kleinere Proteine in die Poren eindringen, was zu einer langsameren Elution führt. Gleichzeitig werden EVs aufgrund ihrer größeren Größe vom Eindringen in die...

Eine Größenausschlusschromatographie-Technik zur Reinigung mykobakterieller extrazellulärer Vesikel

Die bakterielle Zellwand besteht aus Peptidoglycan, einem makromolekularen Netzwerk von Zuckersträngen, die durch Peptide vernetzt sind. Ultra Performance Liquid Chromatography bietet eine hohe Auflösung und Durchsatz für neuartige Entdeckungen der Peptidoglykan-Zusammensetzung. Wir präsentieren ein Verfahren zur Isolierung von Zellwänden (Sacculi) und deren anschließender Vorbereitung auf die Analyse über UPLC.

Isolierung und Vorbereitung von bakteriellen Zellwänden für die Kompositionsanalyse durch Ultra Performance Liquid Chromatographie

Gramnegative Bakterien produzieren zwei räumlich getrennte Membranen. Die äußere Membran wird durch ein Periplasma und eine Peptidoglykanschicht von der inneren Membran abgetrennt. Die Fähigkeit, die beiden Doppelschichten dieser Mikroben zu isolieren, war entscheidend für das Verständnis ihrer Physiologie und Pathogenese.

Trennung der Zellhülle für gramnegative Bakterien in innere und äußere Membranfraktionen mit technischen Anpassungen für Acinetobacter baumannii

Es wird ein Protokoll vorgestellt, um den Gesamtlipidgehalt der Zellwand einer Vielzahl von Mykobakterien zu extrahieren. Darüber hinaus werden Extraktions- und Analyseprotokolle der verschiedenen Arten von Mykolsäuren gezeigt. Ein dünnschichtchromatographisches Protokoll zur Überwachung dieser mykobakteriellen Verbindungen wird ebenfalls bereitgestellt.

Analyse der Lipidzusammensetzung von Mykobakterien mittels Dünnschichtchromatographie

Bakterielle Vesikel spielen eine wichtige Rolle bei der Pathogenese und haben vielversprechende biotechnologische Anwendungen. Die Heterogenität der Vesikel erschwert die Analyse und Verwendung; Daher ist eine einfache, reproduzierbare Methode zur Trennung unterschiedlicher Größen von Vesikeln erforderlich. Hier demonstrieren wir die Verwendung der Größenausschlusschromatographie zur Trennung heterogener Vesikel, die von Aggregatibacter actinomycetemcomitansproduziert werden.

Größenausschlusschromatographie zur Analyse der Heterogenität bakterieller äußerer Membranvesikel

Dieses Protokoll beschreibt die Größenausschlusschromatographie, eine einfache und reproduzierbare Technik zur Anreicherung von Mycobacterium tuberculosis extrazellulären Vesikeln aus Kulturüberständen.

Mycobacterium tuberculosis Extrazelluläre Vesikelanreicherung durch Größenausschlusschromatographie

Dieses Protokoll beschreibt die Anreicherung nativer mykobakterieller extrazellulärer Vesikel (mEVs) aus axenischen Kulturen von Mycobacterium smegmatis (Msm) und wie mCherry (ein rot fluoreszierender Reporter) enthaltende rekombinante MsmEVs entworfen und angereichert werden können. Schließlich wird der neuartige Ansatz mit der Anreicherung von MsmEVs verifiziert, die das EsxA-Protein von Mycobacterium tuberculosis enthalten.

Anreicherung nativer und rekombinanter extrazellulärer Vesikel von Mykobakterien

Obwohl Prokaryoten kein organelläres System haben, gibt es subzelluläre Regionen mit lokalisierten Proteinen. Die quantitative und qualitative Analyse der Enzyme und Proteine in den subzellulären Regionen ist wichtig für die Entwicklung von Wirkstoff- und Impfstoffzielen. Hier veranschaulichen wir die subzelluläre Fraktionierung von Leptospiral-Proteinen mit Hilfe von Triton X-114 und deren Analyse.

Anreicherung subzellulärer Proteine in Leptospiren mit einem Triton X-114-basierten Fraktionierungsansatz

Dieses Protokoll beschreibt die Kultivierung, Ernte und Konzentration von sezernierten Proteinen von Mycobacterium tuberculosis. Kulturfiltratproteine (CFPs) werden quantifiziert, durch isoelektrische Fokussierung in 20 Fraktionen getrennt und mit einem präparativen SDS-PAGE und einem Elektroelutionssystem weiter in 30 Fraktionen aufgelöst.

Trennung und Fraktionierung von Kulturfiltratproteinen (CFPs) aus Mycobacterium tuberculosis

Lernen Sie die Trennung von Zellwand- und Zellmembranproteinen aus Mycobacterium tuberculosis mittels präparativer isoelektrischer Fokussierung und SDS-PAGE. Diese Methode ermöglicht die direkte Anwendung in proteomischen und immunologischen Assays.

Trennung und Fraktionierung von Zellwand- und Zellmembranproteinen aus Mycobacterium tuberculosis für die nachgeschaltete Proteinanalytik (Video) | JoVE Journal

Trennung und Fraktionierung von Zellwand- und Zellmembranproteinen aus Mycobacterium tuberculosis für die nachgeschaltete Proteinanalytik

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