Trennung und Fraktionierung von Zellwand- und Zellmembranproteinen aus Mycobacterium tuberculosis für die nachgeschaltete Proteinanalytik

Unsere Forschung konzentrierte sich auf die Entwicklung einer optimierten Methode zur Trennung unlöslicher Zellwand- und Zellmembranproteine von Mycobacterium tuberculosis in einfache Fraktionen für direkte proteomische und immunologische Assays. Fortschritte in den elektrophoretischen Techniken ermöglichen es nun, komplexe Proteine in weniger Proteinfraktionen zu trennen, was eine effiziente Massenspektrometrie-basierte Isolierung für funktionelle proteomische und immunologische Anwendungen ermöglicht. Zu den größten Herausforderungen gehören die schlechte Löslichkeit von hydrophoben Proteinen, die über hundert Milligramm ausfallen, und die SDS-PAGE-induzierte Denaturierung, die eine nachgelagerte Anwendung behindert, die eine native Bestätigung erfordert, wie z. B. Enzymaktivitätsassays.

Kein aktuelles Protokoll trennt unlösliche hydrophobe Zellwand- und Zellmembranproteine systematisch in definierte wasserlösliche Fraktionen für die direkte proteomische und immunologische Analyse, was für das Verständnis der Funktion und die Steuerung von Interventionen von entscheidender Bedeutung ist. Unsere zukünftige Forschung wird sich auf die Entwicklung von T-Zell-Antigen-basierten Diagnostika konzentrieren und deren Sensitivität, Spezifität und Leistung in der gesamten TB-Population für einen frühen, genauen TB-Nachweis mit dem Ziel einer besseren Krankheitskontrolle bewerten. Zu Beginn erhalten Sie die Zellwand-, Zellmembran- und zytosolischen Proteinproben aus dem Ganzzelllysat von Mycobacterium tuberculosis-Bazillen.

Solubilisieren Sie die Zellwand- und Zellmembranproteine in isoelektrisch fokussierendem Puffer. Fügen Sie 2%Ampholyte zwischen pH-Bereichen von 3 bis 10 und 4 bis 6 in einem Verhältnis von eins bis vier hinzu. Fraktionieren Sie nun die gelösten Proteine in einem flüssigen isoelektrischen Fokussierungssystem, das mit einem kühlen Wasserbad bei vier Grad Celsius gehalten wird.

Führen Sie die isoelektrisch fokussierende Trennung gemäß den Anweisungen des Herstellers durch, indem Sie eine konstante Leistung von 12 Watt anwenden. Sammeln Sie die einzelnen isoelektrisch fokussierenden Fraktionen mit einer Vakuumpumpe. Bestimmen Sie die pH-Werte jeder Fraktion.

50 Mikrogramm der abgetrennten Fraktionen werden der SDS-PAGE unterzogen und die Proteine mittels Coomassie Brilliant Blue oder Silberfärbung visualisiert. Beginnen Sie mit dem Mischen der IEF-separierten Zellwand- und Zellmembranfraktionen mit dem SDS-Gelelektrophorese-Probenpuffer. Erhitze die Mischung fünf Minuten lang bei 95 Grad Celsius.

Trennen Sie die Proteinfraktionen in der zweiten Dimension mit 16 x 20 Zentimeter großen Polyacrylamid-Gelen mit einem 12,5 % auflösenden Gel und einem 4 %-Stapelgel. Verwenden Sie dann eine einzelne 13 Zentimeter lange Probenvertiefung, um die Probe auf das Gel zu laden. Führen Sie die Elektrophorese bei einem konstanten Strom von 50 Milliampere pro Gel durch, bis die Farbstofffront den Boden des Gels erreicht.

Nach der Elektrophorese äquilibrieren Sie das Gel 10 Minuten lang in Elutionspuffer. Übertragen Sie das Gel gemäß den Anweisungen des Geräteherstellers auf ein ganzes Gel-Eluter-Gerät. Lassen Sie den Eluter eine Stunde lang mit einem konstanten Strom von 250 Milliampere laufen, um die Proteine aus dem Gel zu eluieren, und verwenden Sie dann eine Vakuumpumpe, um etwa 30 Proteinfraktionen mit einer Größe von jeweils drei Millilitern aus dem Gel zu sammeln.

Quantifizieren Sie die Proteinkonzentration in den eluierten Fraktionen mit dem Bicinchoninsäure-Protein-Assay. 10 Mikrogramm der eluierten Proteinfraktionen werden einer SDS-PAGE-Analyse unterzogen und die Banden durch Coomassie Brilliant Blue-Färbung visualisiert. Ausgeprägte Proteinbandenmuster wurden in den ersten Überstands-, Zellwand-, Zellmembran- und Zytosolfraktionen von Mycobacterium tuberculosis beobachtet, was die erfolgreiche subzelluläre Fraktionierung bestätigt.

Die isoelektrische Fokussierung von Zellwandproteinen zeigte die höchste Proteinkonzentration in Fraktionen mit einem pH-Wert unter 2,5. SDS-PAGE der Zellwand-IEF-Fraktionen zeigten unterschiedliche Proteinbanden, vorwiegend in den Fraktionen 1 bis 8. Die Proteintrennung auf der Zellmembran mittels IEF ergab große Proteinkonzentrationsspitzen zwischen pH 4 und pH 10, wobei die höchste Konzentration bei pH 10 auftrat.

SDS-PAGE der IEF-Fraktionen der Zellmembran zeigte in den Fraktionen 1 bis 9 unterschiedliche Proteinprofile mit klareren Banden. Die präparative SDS-PAGE-Trennung der IEF-aufgelösten Zellwandproteine produzierte Fraktionen überwiegend unter 100 Mikrogramm pro Milliliter. SDS-PAGE der eluierten Zellwandproteinfraktionen zeigte einen breiten Bereich von Proteinmolekulargewichten, mit stärker konzentrierten Banden in den Fraktionen 6 bis 10.

Die präparative SDS-PAGE von Zellmembranproteinfraktionen zeigte, dass mehr als die Hälfte der Fraktionen Proteinkonzentrationen zwischen 50 und 199 Mikrogramm pro Milliliter aufwiesen. SDS-PAGE der eluierten Zellmembranproteinfraktionen zeigten konzentrierte Banden in den Spuren 1 bis 8 und 13 bis 16.