In situ Isolierung und Kultivierung von widerspenstigen Bodenbakterien mit Hilfe eines Isolation Chips (iChip)

Reichhaltige Repositorien von Mikroben existieren in verschiedenen natürlichen Umgebungen wie Böden, Gewässern und extremen Umgebungen. Die Erschließung dieser enormen Artenvielfalt ist jedoch durch Labormethoden und -medien weitgehend begrenzt. Durch die Überwindung dieser Kulturbarriere und die Erschließung dieser biologischen Vielfalt haben wir das Potenzial, verschiedene biotechnologische Bedürfnisse zu erfüllen und globale Herausforderungen zu lösen.

So ist beispielsweise die Entwicklung von Antibiotikaresistenzen zu einem festen Bestandteil der globalen öffentlichen Gesundheit geworden. Bodenbakterien, die im Labor schwer zu kultivieren sind, können neuartige bioaktive Verbindungen mit starker antimikrobieller Aktivität produzieren, die bei der Bewältigung der globalen Herausforderung antimikrobieller Systeme wertvoll sein könnten. Die enorme Vielfalt an Umweltmikroben und ihren Produkten wurde bisher nicht erforscht, da traditionelle laborkulturbasierte Technologien oft zur Isolierung ähnlicher bekannter Mikroben führen. Ziel dieses Experiments ist es, die Hochdurchsatzkultur von widerspenstigen Bodenbakterien in-situ mit der IChip-Technologie zu demonstrieren. In diesem Protokoll demonstrieren wir die Konstruktion und Verwendung dieser IChip-Technologie, die für die In-situ-Kultivierung von schwer zu kultivierenden Bakterien mit hohem Durchsatz und die Rückgewinnung von antimikrobiell produzierenden Bakterien als Anwendung dieser Technologie verwendet werden kann.

[Moderator] Erstellen Sie zunächst einen Vorentwurf der oberen, unteren und mittleren Platten des Isolationschips in einer Präsentationssoftware. Verwenden Sie die Option "Form einfügen" in der Präsentationssoftware, um Kreise mit notwendigen Abmessungen einzufügen, die als IChip dienen sollen. Fügen Sie kleinere Kreise ein, um IChip-Kanäle darzustellen. Ordnen Sie die kleineren Kreise im gewünschten Muster an, um einen Vorentwurf für die obere, untere und mittlere Platte des IChip vorzubereiten. Wählen Sie den Entwurf aus und verwenden Sie das Kontextmenü, um den Vorentwurf als Bild zu speichern. Beginnen Sie mit dem Vorentwurf als Vorlage und beginnen Sie mit der Erstellung eines zweidimensionalen Entwurfs mit einer computergestützten Konstruktionssoftware. Fügen Sie im Skizzenmenü vordefinierte Formen, hauptsächlich Kreise, ein, um das Grunddesign für die IChip-Platten und den Bereich der Kanäle zu erstellen. Verwenden Sie die Bemaßungsoption, um die tatsächlichen Abmessungen der Platten und Kanäle festzulegen. Klicken Sie auf OK, um das Design fertigzustellen, und verwenden Sie dann die Extrusionsfunktion, um das 2D-Design in ein 3D-Modell mit der gewünschten Dicke umzuwandeln. Verwenden Sie abschließend das Dateimenü, um eine Kopie des 3D-Modells in dem für den 3D-Druck kompatiblen Standbild-Dateiformat zu speichern.

[Moderator] Sammeln Sie alle wichtigen Gegenstände, die für die Entnahme von Bodenproben erforderlich sind, und erreichen Sie den Ort, an dem die Probe entnommen werden soll. Öffnen Sie die mobile Anwendung "Geokodierung", suchen Sie die eindeutige Adresse der Probenahmestelle, die aus drei Wörtern besteht, und notieren Sie sie. Notieren Sie als Nächstes relevante Metadaten für Proben, z. B. Temperatur, Datum, Uhrzeit, Tiefe der Probenahme, Wetter und Exposition des Standorts gegenüber den Elementen. Besprühen Sie eine Schaufel und die Styroporbox, in die der IChip gepflanzt werden soll, mit 70% Ethanol. Wischen Sie sie mit Seidenpapier sauber und lassen Sie das Ethanol vollständig an der Luft trocknen. Verwenden Sie dann die dekontaminierte Schaufel, um Oberflächenschmutz wie Laub oder Steine zu entfernen, um den Mutterboden freizulegen. Dekontaminieren Sie die Schaufel wieder wie bisher. Greifen Sie mit der Schaufel in einer Tiefe von drei bis sechs Tieren auf den Boden zu und geben Sie etwa vier bis fünf kg Erde aus einer gleichmäßigen Tiefe in die Styroporbox. Die Box sollte zu ca. 75 % gefüllt sein. Transportieren Sie die gesammelte Erde sofort zurück ins Labor. Wiegen Sie aus der gesammelten Bodenprobe ein Gramm Erde, die frei von Ablagerungen, Steinen und Laubstreu ist, in ein steriles 50-mil-Zentrifugenröhrchen mit 10 ml steriler Kochsalzlösung. Mischen Sie die Erde mit der Kochsalzlösung, während Sie sie etwa 10 Sekunden lang vortexen, um eine Erdaufschlämmung zu erhalten. Lassen Sie das Zentrifugenröhrchen fünf Minuten lang ungestört, damit sich die großen Bodenpartikel im Röhrchen absetzen können. Übertragen Sie dann die überstehende Bodensuspension vorsichtig in ein frisches Reagenzglas mit der Bezeichnung S. Unter Verwendung der Bodensuspension als unverdünnte Probe führen Sie eine Nullverdünnung durch, indem Sie einen ml der Probe in neun ml sterile Kochsalzlösung in einem frischen Röhrchen überführen. Bereiten Sie die Verdünnung von 10 ist zu Leistung minus eins auf 10 ist zu Leistung minus fünf. Dekontaminieren Sie in einer Biosicherheitswerkbank die obere Platte, die untere Platte und die mittlere Platte des IChip, indem Sie 10 Minuten lang in 70 % Ethanol einweichen. Spülen Sie das überschüssige Ethanol ab, indem Sie die IChip-Komponenten mit sterilem entionisiertem Wasser waschen und in einer sterilen Petrischale an der Luft trocknen lassen. Legen Sie die mittlere Platte des IChip in eine sterile Petrischale, bereit für die Aussaat. Schmelzen Sie das SMS-Agar-Medium in der Mikrowelle. Lassen Sie es abkühlen und geben Sie dann 22,5 ml SMS-Agar bei 45 Grad in ein steriles 50-ml-Zentrifugenröhrchen. Zu diesem werden 2,5 ml einer geeigneten Verdünnung der Bodenprobe hinzugefügt und durch sanftes Umkehren gut gemischt, wobei das Eindringen von Luftblasen vermieden wird. Gießen Sie langsam etwa drei bis vier ml des ausgesäten SMS-Agar-Mediums über die mittlere Platte des IChip, die die gesamte Oberfläche bedeckt. Lassen Sie dann das SMS-Agar-Medium etwa fünf bis 10 Minuten lang aushärten. Prüfen Sie, ob das SMS-Agar-Medium eingestellt ist. Kratzen Sie dann mit der sterilen Rasierklinge das überschüssige SMS-Agar von der Oberfläche der IChip-Metallplatte ab und lassen Sie die Agar-Stopfen in den einzelnen Diffusionskammern zurück. Nachdem Sie die Schutzfolie von einem der 0,03 Mikrometer großen Polycarbonat-Membranfilter entfernt haben, legen Sie sie vorsichtig mit einer sterilen Pinzette auf die Innenseite der oberen Klinge des IChip. Platzieren Sie dann mit einer sterilen Pinzette einen weiteren 0,03 Mikrometer großen Polycarbonat-Membranfilter auf der freiliegenden Seite der besäten Metallplatte. Platzieren Sie die obere und untere Platte des IChip, indem Sie die mittlere Platte und die Polycarbonatmembranen einschließen, und achten Sie darauf, dass diese Schraubenlöcher in allen Platten ausgerichtet sind, um die IChip-Montage abzuschließen. Ziehen Sie die Schrauben und Muttern fest an, um die IChip-Baugruppe zu sichern. Erzeugen Sie mit einer sterilen Schaufel eine Vertiefung, die größer als die Größe des IChip ist, im Erdsammler in der Styroporbox. Platzieren Sie die IChip-Baugruppe senkrecht in der Vertiefung und verpacken Sie sie fest mit Erde, um sicherzustellen, dass alle Oberflächen der IChip vollständig bedeckt sind. Lassen Sie dann die In-situ-Kultur für die gewünschte Dauer von zwei bis vier Wochen in Kultur. Während der Inkubation wird die Bodenumgebung, das gepflanzte IChip, regelmäßig mit sterilem destilliertem Wasser befeuchtet, um ein Austrocknen der ausgesäten SMS-Agar-Pfropfen in der Diffusionskammer zu verhindern. Nach der gewünschten Inkubation entfernen Sie vorsichtig die Erde um das gepflanzte IChip, um sie zurückzugewinnen. Waschen Sie dann das IChip mit steriler Kochsalzlösung, um anhaftende Schmutzpartikel zu entfernen, und überführen Sie es zur weiteren Verarbeitung in eine Biosicherheitswerkbank. Lösen Sie die Schrauben und Muttern von der IChip-Baugruppe, und zerlegen Sie die IChip vorsichtig. Entfernen Sie mit einer sterilen Pinzette die Polycarbonatmembranen und übertragen Sie die mittlere Platte des IChip in die vorbereitete Petrischale. Verwenden Sie einen sterilen Holzapplikator, um die einzelnen Agarpfropfen in jeder Diffusionskammer zu gewinnen. Impfen Sie die Agar-Plugs in geeignete Medien wie SMS-Agar oder 0,1-faches tryptisches Sojabrühe-Agar, um die Laborkultivierung zu versuchen. Kultivierte Isolate können dann mit Routinemethoden, wie z. B. Agar-Overlay mit Testerstämmen, auf die antimikrobielle Produktion untersucht werden. Hier zeigen wir repräsentative Screening-Ergebnisse für 12 Kulturen, IC-1 bis 12, die aus IChip-Agar-Plugs gegen Staphylococcus aureus ATCC 29213 und Acinetobacter baumannii B8342 gewonnen wurden. Beachten Sie, dass die Kulturen IC-6 und IC-8 Aktivität gegen grampositive bzw. gramnegative Testerstämme zeigen. Alternativ können Sie die geborgenen Agarpfropfen, die in situ kultivierte widerspenstige Bodenbakterien enthalten, färben und abbilden, um das Wachstum von Mikrokolonien unter in-situ-Bedingungen zu bestätigen. Mit diesem Ansatz ist es möglich, widerspenstige Bodenbakterien in-situ mit hohem Durchsatz zurückzugewinnen. Das 3D-gedruckte IChip kann 156 Agar-Plugs aufnehmen. Es ist jedoch notwendig, während der Aussaat die richtige Verdünnung zu wählen, um sicherzustellen, dass eine Bakterienzelle in jeden Kanal des IChip ausgesät wird. Die benötigten Bakterien können dann auf gewünschte Bioaktivitäten wie Metabolitenproduktion, Enzymproduktion, Biopolymerproduktion usw. untersucht werden, wenn sie unter Laborbedingungen kultiviert werden können. Es ist jedoch auch wahrscheinlich, dass einige Bakterien unter Laborbedingungen nicht wachsen, und in solchen Fällen müssen wir möglicherweise metagenomische Ansätze anwenden, um das Vorhandensein von Mikroben zu erkennen und ihr biosynthetisches Potenzial zu nutzen. Die beschriebene Methode ist sehr einfach und kann mit geringfügigen Modifikationen problemlos für die Bioprospektion von Mikroben unter verschiedenen Umweltbedingungen eingesetzt werden.