Name: Volumetrische Bildgebung und Analyse von primären Zilien im Muskel-Skelett-Gewebe mit dem Mausmodell ARL13B-CENTRIN-2 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-28T13:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Lernen Sie die dreidimensionale Bildgebung primärer Zilien im Wachstumsplattenknorpel mit dem transgenen Mausmodell ARL13B-CENTRIN-2. Diese Methode ermöglicht präzise Analysen zur Morphogenese.

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<ol><li>Wheatley, D. N., Wang, A. M., Strugnell, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+primary+cilia+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol+Int%22%5BJournal%5D)">Expression of primary cilia in mammalian cells.</a> Cell Biol Int. 20 (1), 73-81 (1996).</li>
<li>Donnelly, E., Ascenzi, M. G., Farnum, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilia+are+highly+oriented+with+respect+to+collagen+direction+and+long+axis+of+extensor+tendon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Primary cilia are highly oriented with respect to collagen direction and long axis of extensor tendon.</a> J Orthop Res. 28 (1), 77-82 (2010).</li>
<li>McGlashan, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+loading+modulates+chondrocyte+primary+cilia+incidence+and+length%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol+Int%22%5BJournal%5D)">Mechanical loading modulates chondrocyte primary cilia incidence and length.</a> Cell Biol Int. 34 (5), 441-446 (2010).</li>
<li>Farnum, C. E., Wilsman, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orientation+of+primary+cilia+of+articular+chondrocytes+in+three-dimensional+space%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Orientation of primary cilia of articular chondrocytes in three-dimensional space.</a> Anat Rec. 294 (3), 533-549 (2011).</li>
<li>Coveney, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ciliary+protein+IFT88+controls+post-natal+cartilage+thickness+and+influences+development+of+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Arth+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">The ciliary protein IFT88 controls post-natal cartilage thickness and influences development of osteoarthritis.</a> Arth Rheumatol. 74 (1), 49-59 (2021).</li>
<li>Coveney, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+IFT88+protects+coordinated+adolescent+growth+plate+ossification+from+disruptive+physiological+mechanical+forces%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Ciliary IFT88 protects coordinated adolescent growth plate ossification from disruptive physiological mechanical forces.</a> J Bone Miner Res. 37 (6), 1081-1086 (2022).</li>
<li>Andrea, C. E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilia+organization+reflects+polarity+in+the+growth+plate+and+implies+loss+of+polarity+and+mosaicism+in+osteochondroma%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Primary cilia organization reflects polarity in the growth plate and implies loss of polarity and mosaicism in osteochondroma.</a> Lab Invest. 90 (7), 1091-1101 (2010).</li>
<li>Ascenzi, M. -G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+localization%2C+length+and+orientation+of+chondrocytic+primary+cilium+on+murine+growth+plate+organization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Theor+Biol%22%5BJournal%5D)">Effect of localization, length and orientation of chondrocytic primary cilium on murine growth plate organization.</a> J. Theor Biol. 285 (1), 147-155 (2011).</li>
<li>Bangs, F. K., Schrode, N., Hadjantonakis, A. K., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+specificity+of+primary+cilia+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lineage specificity of primary cilia in the mouse embryo.</a> Nat. Cell Biol. 17 (2), 113-122 (2015).</li>
<li>Larkins, C. E., Aviles, G. D. G., East, M. P., Kahn, R. A., Caspary, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arl13b+regulates+ciliogenesis+and+the+dynamic+localization+of+Shh+signaling+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Arl13b regulates ciliogenesis and the dynamic localization of Shh signaling proteins.</a> Mol Biol Cell. 22 (23), 4694-4703 (2011).</li>
<li>Higginbotham, H., Bielas, S., Tanaka, T., Gleeson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mouse+line+with+green-fluorescent+protein-labeled+Centrin+2+allows+visualization+of+the+centrosome+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Transgenic mouse line with green-fluorescent protein-labeled Centrin 2 allows visualization of the centrosome in living cells.</a> Transgenic Res. 13 (2), 155-164 (2004).</li>
<li>arivis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Application+Note+%2347+-+Applying+Cellpose+models+in+arivis+Vision4D%22">Application Note #47 - Applying Cellpose models in arivis Vision4D</a>. , 1-20 (2021).</li>
<li>Huff, J., Bergter, A., Luebbers, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+Note%3A+Multiplex+mode+for+the+LSM+9+series+with+Airyscan+2%3A+fast+and+gentle+confocal+super-resolution+in+large+volumes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Application Note: Multiplex mode for the LSM 9 series with Airyscan 2: fast and gentle confocal super-resolution in large volumes.</a> Nat Methods. , (2019).</li>
<li>Ning, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilia-associated+wound+repair+mediated+by+IFT88+in+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Cilia-associated wound repair mediated by IFT88 in retinal pigment epithelium.</a> Sci Rep. 13 (1), 8205-8219 (2023).</li>
<li>Palla, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilia+on+muscle+stem+cells+are+critical+to+maintain+regenerative+capacity+and+are+lost+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Primary cilia on muscle stem cells are critical to maintain regenerative capacity and are lost during aging.</a> Nat Commun. 13 (1), 1439-1451 (2022).</li>
<li>Brewer, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+dynamic+ciliary+ARL13B+and+ADCY3+localization+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Postnatal dynamic ciliary ARL13B and ADCY3 localization in the mouse brain.</a> Cells. 13 (3), 259-277 (2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>22 x 50 mm Deckgläser</td><td>fisherscientific&nbsp;</td><td></td><td></td>12373128</tr><tr><td>arivis Vision4D Software</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>Bildanalyse-Software&nbsp;</td></tr><tr><td>Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss 980 Airyscan 2</td><td></td></tr><tr><td>CoverGrip Deckglas Dichtstoff&nbsp;</td><td>Biotium&nbsp;</td><td>23005</td><td></td></tr><tr><td>Kryofilm Typ 3C(16UF) (Blatttyp) 2,0 cm breit</td><td>Sektionslabor</td><td>C-FUF303</td><td>Direkt beim Sektionslabor zu erwerben</td></tr><tr><td>Kryostat</td><td>Leica</td><td>CM1900 UV</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Basisformen&nbsp;</td><td>epredia</td><td>58952</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>gibco</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Formalin</td><td>Sigma</td><td>20260630</td><td></td></tr><tr><td>Imaris Software&nbsp;</td><td>Oxford Instruments&nbsp;</td><td>N/A</td><td>Bildanalysesoftware für die 3D-Rekonstruktion&nbsp;</td></tr><tr><td>Immersionsöl 518F</td><td>Zeiss</td><td>ISO 8036&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom-Klingen</td><td>Feather</td><td>02.075.00.006</td><td></td></tr><tr><td>SlowFade Glas Antifade Eindecker&nbsp;</td><td>invitrogen</td><td>S36917</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Super Cryoembedding Medium (SCEM)</td><td>Section-lab</td><td>C-EM001</td><td>Direkt beim Section-lab zu erwerben</td></tr><tr><td>Superfrost Plus Objektträger</td><td>avantor</td><td>631-0108</td><td></td></tr><tr><td>Zen-Software</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>Freeware für konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie</td></tr></tbody></table>

volumetrische bildgebung und analyse von primären zilien im muskel-skelett-gewebe mit dem mausmodell arl13b-centrin-2

Volumetric Imaging and Analysis of Primary Cilia in Musculoskeletal Tissue using the ARL13B-CENTRIN-2 Mouse Model

Die Wachstumsfuge einer 6 Wochen alten Maus wurde unter Verwendung des beschriebenen Protokolls abgebildet und die primäre Zilienorganisation im Gewebe kartiert. Ein Bild aller drei Regionen der Wachstumsfuge - ruhend, proliferativ und hypertroph - wurde aufgenommen und durch die Analysepipeline geleitet (Abbildung 2A). Einzelne Zellen können mit der DAPI-Färbung identifiziert werden, wobei ihr ziliäres Axonem in rot und ihre Zentriolen in grün sind. Die Auflösung mit dieser Methode ist hoch genug, um einzelne Zentriolen zu unterscheiden (Abbildung 2B). Bei dieser Auflösung können die Flimmerhärchen in ihrer 3D-Umgebung visualisiert werden, wobei sie in verschiedene Richtungen zeigen (Video 1).
Bilder mit niedrigerer Auflösung und Objektiven höherer Vergrößerung können ebenfalls aufgenommen werden, um primäre Zilien in einer größeren Geweberegion zu visualisieren. Diese sind jedoch nicht für die Analyse der Zilienorientierung in 3D geeignet. So wurden beispielsweise die primären Flimmerhärchen im Gelenkknorpel mit dem 20x-Objektiv abgebildet, was zeigt, dass die Methode auch bei anderen Geweben funktioniert (Abbildung 2C). Bei dieser Auflösung sind die ziliären Axoneme in Rot zu erkennen, aber die Zentriolen sind schwieriger zu unterscheiden. Der subchondrale Knochen neigt dazu, viele GFP-Hintergrundsignale zu präsentieren, was die Identifizierung von Zentriolen in diesem Gewebe erschwert.
Die Pipeline kann einzelne Zellen, primäre Zilien und Zentriolen nachweisen und eignet sich für hochorganisierte junge Wachstumsfugen und ältere Wachstumsplatten, bei denen die Säulen weniger gut definiert sind, wie bei 10 Wochen alten Mäusen (Abbildung 3). Zellen und Zilien werden in 3D detektiert, wie sie auf dem gesamten Z-Stack zu sehen sind.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67693/67693fig01.jpg"> 
Abbildung 1: Experimenteller Arbeitsablauf. Flussdiagramm der verschiedenen Schritte im Protokoll von der Gewebeentnahme bis zur Bildanalyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67693/67693fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67693/67693fig02.jpg"> 
Abbildung 2: Primäre Zilien in murinen Geweben der ARL13B-CENTRIN-2-Maus. (A) Eine 6 Wochen alte Wachstumsfuge mit DAPI in weiß, CENTRIN-2 in grün und ARL13B in rot, aufgenommen mit dem 40x-Objektiv. (B) Vergrößern Sie ein einzelnes primäres Zilium und seine beiden Zentriolen. (C) Gelenkknorpel und subchondraler Knochen einer 4 Wochen alten Maus, aufgenommen mit dem 20x-Objektiv. (D) Niere einer 6 Wochen alten Maus, die mit der gleichen Pipeline wie für Muskel-Skelett-Gewebe aufgenommen wurde. (E) Vergrößerung des weißen Kastens in D , der einzelne primäre Zilien und ihre Zentriolen in der Niere zeigt. Maßstabsleisten = 20 μm (A,D), 4 μm (B), 60 μm (C), 6 μm (E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67693/67693fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67693/67693fig03.jpg"> 
Abbildung 3: Pipeline zur Detektion von Zellen und Zilien. Beispielhafte Anwendung der Bildanalyse-Pipeline auf einer 10 Wochen alten Wachstumsfuge. (A) Das Bild wurde in der Software geöffnet. (B) Ergebnis der Zelldetektionspipeline. (C) Ergebnis der Nachweisleitung für Zilien und Zentriolen. Die Flimmerhärchen sind rosa und die Zentriolen grün. Die Seitenansicht zeigt, dass die Auflösung hoch genug ist, um Flimmerhärchen, die in verschiedene Richtungen ausgerichtet sind, in 3D zu unterscheiden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67693/67693fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Video 1: Dreidimensionale Rekonstruktion einer 6 Wochen alten Wachstumsfuge aus der ARL13B-CENTRIN-2 Maus. Die dreidimensionale Rekonstruktion wurde in der Software Imaris durchgeführt und als Animationsvideo aufgezeichnet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67693/Video-1.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.</a>
Ergänzende Abbildung S1: Einstellungen für die Bildaufnahme am Mikroskopsystem. (A) Smart Setup-Fenster , um die Kanäle hinzuzufügen und den Airyscan-Modus auszuwählen. (B) Kachel-Viewer zum Auswählen und Anzeigen einer Vorschau der Kacheln, die abgebildet werden sollen. (C) Airyscan-Detektor-Anpassungsfenster , in dem die Ausrichtung der Airyscan-Detektoren bestätigt wird, sobald alle Kacheln grün werden. (D) Lasereinstellungen für die drei Kanäle. (E) Einstellungen für den Erfassungsmodus und den Z-Stapel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67693/Supp-file-1.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Abbildung S2: Bildverarbeitungseinstellungen am Mikroskopsystem. (A) Einstellungen für die Airyscan-Verarbeitung. (B) Einstellungen für das Sticken. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67693/Supp-file-2.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Abbildung S3: Benutzerdefinierte Bildanalyse-Pipelines. (A) Zelldetektionspipeline unter Verwendung der GFP- und DAPI-Kanäle. (B) Primäre Zilien- und Zentriol-Detektionspipeline unter Verwendung der mCherry- bzw. GFP-Kanäle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67693/Supp-file-3-.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Volumetrische Bildgebung und Analyse von primären Zilien im Muskel-Skelett-Gewebe mit dem Mausmodell ARL13B-CENTRIN-2

The primary cilium is a non-motile, solitary organelle assembled by most cell types. It is essential to the development and homeostasis of the skeleton ...

Um die wachsende Gliedmaße besser zu verstehen, untersuchten wir das primäre Zilium, eine Organelle, die eine Schlüsselrolle bei der Regulierung der Reaktion der Zellen auf ihre Umgebung spielt. Um die Rolle der Zilien beim Wachstum zu untersuchen, stellen wir sie in der Wachstumsfuge dar, einer Knorpelschicht, in der neuer Knochen wächst. Das primäre Zilium ist mit weniger als fünf Mikrometern extrem klein, was die Abbildung vor allem in drei Dimensionen erschwert.Die Abbildung in matrixreichen, teilweise verkalkten Geweben wie Knorpel und Knochen macht es nur noch schwieriger, ihr Vorhandensein, ganz zu schweigen von Position, Ausrichtung und Größe, genau zu untersuchen. Wir können die 3D-Organisation der primären Zilien in allen Zellen innerhalb der Wachstumsfuge abbilden und fragen, ob kranke Zellen eine Zelle an einem Ort zusammensetzen, an dem sie in Bezug auf die Gewebemorphogenese ausgerichtet ist. Primäre Zilien wurden bisher nur in 2D in Wachstumsfugen oder in sehr geringer Zahl untersucht.Die endogenen Fluoreszenzsignale für das Zilium und die Zentriolen erhöhen die Sicherheit der Ziliaridentifizierung aufgrund des hohen Signal-Rausch-Verhältnisses und vermeiden die Notwendigkeit einer Immunhistochemie. Dieses Protokoll ermöglicht auch die kollektive Bildgebung von Hunderten von Zilien im Gewebe mit hohem Durchsatz, was es uns ermöglicht, Zilien räumlich mit den von uns untersuchten Ereignissen der Morphogenese in Beziehung zu setzen. Diese Bildgebungs- und Analysemethode kann auf andere Gewebe angewendet werden, um primäre Zilien in Geweben und Organen zu kartieren.Dies wird ein besseres Verständnis des Zusammenhangs zwischen der Struktur und Funktion der primären Zilien ermöglichen. Nehmen Sie zunächst den vorbereiteten gefrorenen Kryoschnitt des Mausgewebes und legen Sie den Objektträger zum Auftauen horizontal bei Raumtemperatur. Waschen Sie den Objektträger mit einem Tropfen PBS für drei Zyklen von jeweils fünf Minuten, um den Schein zu entfernen.Tragen Sie 10-mikromolare DAPI-Lösung auf den Objektträger auf und färben Sie ihn eine Minute lang ein. Montieren Sie dann die Probe, decken Sie sie mit einem Deckglas ab und lassen Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur stehen. Versiegeln Sie die Ränder des Deckglases mit Deckglas-Dichtmittel.Um das Konfokalmikroskop einzurichten, schalten Sie es ein, öffnen Sie die Software und klicken Sie auf die Schaltfläche System. Klicken Sie auf der Registerkarte "Acquisition" auf "Smart Setup", um die Kanäle einzurichten und die Kanäle GFP, mCherry und DAPI hinzuzufügen. Wählen Sie dann die Option ARI Scan und die Funktion sR8-Y aus dem ARI-Scan-Dreieck zwischen Auflösung und Geschwindigkeit.Klicken Sie auf Bestes Signal und dann zur Bestätigung auf OK. Wählen Sie auf der Registerkarte "Lokalisieren" unter "Mikroskopsteuerung" das 40-fach- und das 1,4-fache Objektiv mit Ölimmersion aus. Legen Sie dann den Objektträger in den Objektträgerhalter und bringen Sie das Objektiv nach oben, bis das Öl den Abdeckglas berührt.Positionieren Sie dann die Wachstumsfuge oder einen anderen interessierenden Bereich unter dem Strahlengang. Klicken Sie auf der Registerkarte "Lokalisieren" auf "Fluoreszenz" und wählen Sie "DAPI" aus. Bewegen Sie den Gleithalter mit dem Okular mit dem Joystick, um die Wachstumsfuge oder den interessierenden Bereich unter dem Sichtfeld zu positionieren.Wählen Sie auf der Registerkarte "Erfassung" nur den DAPI-Kanal aus. Klicken Sie auf Kontinuierlich, um das Bild des DAPI-Kanals auf dem Bildschirm anzuzeigen und sicherzustellen, dass die Wachstumsfuge sichtbar ist. Um den Kachel-Viewer zu öffnen, klicken Sie auf der Registerkarte Kacheln auf Viewer anzeigen.Fügen Sie die erforderliche Anzahl von Kacheln hinzu, in der Regel eine Kachel in X-Richtung und drei bis fünf Kacheln in Y-Richtung. Klicken Sie dann auf Vorschau und Start. Überprüfen Sie nun, ob die Kacheln die drei Zonen der Wachstumsfuge abdecken: Ruhe, Proliferation und Hypertrophie.Passen Sie bei Bedarf die Position und Anzahl der Kacheln an. Um die Bildparameter einzurichten, klicken Sie auf der Registerkarte Erfassung auf Kontinuierlich. Um den ARI-Scan-Detektor auszurichten, öffnen Sie das Fenster zur Einstellung des ARI-Scan-Detektors, indem Sie unten auf das gekachelte Rosettensymbol klicken.Warten Sie, bis alle Kacheln grün werden. Passen Sie auf der Registerkarte "Kanäle" den Gain-Master und die Laserleistung an, um die Kerne auf dem Bildschirm deutlich zu sehen. Wählen Sie anschließend alle drei Kanäle aus und klicken Sie auf Kontinuierlich, um das Imaging zu starten.Lassen Sie den ARI-Scan-Detektor ausrichten. Definieren Sie auf der Registerkarte Aufnahmemodus die Bildgröße, die Pixelgröße, die Bildgröße, die Geschwindigkeit und die Mittelwertbildung. Aktivieren Sie auf der Registerkarte "Erfassung" das Kontrollkästchen "Z-Stapel", um das Z-Stapel-Imaging zu aktivieren.Wählen Sie dann nur den DAPI-Kanal aus und klicken Sie auf Kontinuierlich, um das Bild auf dem Bildschirm anzuzeigen. Bewegen Sie das Objektiv auf die nächstgelegene Ebene, die abgebildet werden soll. Klicken Sie auf der Registerkarte Z-Stapel auf Erste Ebene festlegen, fokussieren Sie dann weg auf die letzte Ebene, die angezeigt werden soll, und klicken Sie auf Letzte Ebene festlegen, um den Bildbereich zu konfigurieren.Legen Sie das Intervall zwischen den Z-Stapelebenen auf 0,15 Mikrometer fest. Bewegen Sie sich in die Mitte des Z-Stapel-Imaging-Bereichs. Klicken Sie auf der Registerkarte Kacheln unter Kachelbereiche auf Überprüfen und dann auf Z setzen und zu Weiter verschieben.Vergewissern Sie sich nun auf der Registerkarte Fokusstrategie, dass die Fokusstrategie so eingestellt ist, dass Z-Werte und Fokusfläche verwendet werden, die in der Kacheleinrichtung definiert sind. Klicken Sie dann auf Experiment starten, um mit der Bildaufnahme zu beginnen. Um die Bilder zu verarbeiten, gehen Sie zur Registerkarte Verarbeitung, wählen Sie Einzel- oder Stapelmodus, wählen Sie ARI-Scan-Verarbeitung, aktivieren Sie die Option 3D-Verarbeitung und wählen Sie Standard-Autofilter.Wählen Sie das aufgenommene Rohbild aus und starten Sie die Verarbeitung. Nachdem Sie die Verarbeitung des ARI-Scans abgeschlossen haben, wählen Sie in den Verarbeitungsmethoden die Option Stitching aus. Wählen Sie Neue Ausgabe, Sicherungskacheln, Schattierung korrigieren und Alle als Referenz aus, wobei die Referenz als DAPI festgelegt ist.Wählen Sie das ARI-Scan-verarbeitete Bild aus und starten Sie den Stitching-Vorgang. Importieren Sie zunächst die erfasste CZI-Bilddatei in die Software und öffnen Sie das Analysefenster. Wählen Sie im Dropdownmenü Neue Pipeline aus.Verwenden Sie die Schaltfläche Vorgang hinzufügen, um der Pipeline Operatoren hinzuzufügen. Um eine Zellenerkennungspipeline zu erstellen, importieren Sie den Python-Segmenter nach der Zelle in die Pipeline. Stellen Sie den Modellnamen auf Cyto 2, den Eingangskanal auf 2, den zweiten Kanal auf 3 und den Durchmesser in Mikrometern auf 10 ein.Flussschwellenwert auf 0,4 und Schwellenwert für die Zellenwahrscheinlichkeit auf 0. Fügen Sie als Nächstes einen Operator zum Importieren von Dokumentobjekten vor der Pipeline hinzu, und benennen Sie ihn in Manuelle Beschriftungen importieren um. Fügen Sie dann nach der Pipeline einen Objektfeaturefilteroperator hinzu, und benennen Sie ihn in Größenfilter um.Zeichnen Sie den Interessenbereich mit dem Werkzeug Polygon auf der ersten und der letzten Ebene. Benennen Sie das erstellte Objekt um und markieren Sie es. Klicken Sie auf den blauen Pfeil nach vorne am oberen Rand des Analysebereichs, um die Pipeline auszuführen.Um eine primäre Zilien- und Zentriol-Detektionspipeline zu erstellen, öffnen Sie das Analysefenster und wählen Sie Neue Pipeline aus dem Dropdown-Menü aus. Fügen Sie der Pipeline Operatoren hinzu, und passen Sie sie an, z. B. Importdokumentobjekte, zwei Schwellenwertoperatoren, Teilen, Objekt, Feature, Filter und Compartment. Klicken Sie dann auf den blauen Pfeil nach vorne am oberen Rand des Analysebereichs, um die Pipeline auszuführen.Öffnen Sie das Fenster Objekte, wählen Sie das Objekt aus, das die Zellen, primären Zilien und Zentriolen enthält, hier Kompartimentzelle genannt, und klicken Sie auf Import/Export. Wählen Sie Excel-Export aus. Wählen Sie die Funktionen aus, z. B. Anzahl der untergeordneten Elemente, Name, Namen der übergeordneten Elemente, 3D-orientierte gebundene kurze Seite, mittlere Seite, lange Seite, Winkel XY, Winkel XZ, Winkel YZ, Begrenzungsrahmen X1, X2, Y1, Y2, Z1, Z2, Größe X, Größe Y, Größe Z, Mittelpunkt der Geometrie X, Y, Z, Ebene zuerst, letzte, Anzahl, Netz, Volumennetz und Oberflächennetz, das gespeichert werden soll.Die Organisation der primären Zilien wurde erfolgreich in der Wachstumsfuge einer sechs Wochen alten Maus kartiert. Hochauflösende Bildgebung demonstrierte die Fähigkeit, einzelne Zentriolen und primäre Zilien in ihrer dreidimensionalen Umgebung sichtbar zu machen. Zellen und primäre Zilien werden in 3D mit Hilfe der Bildanalyse-Pipeline detektiert, die primäre Zilien, die zur Seite zeigen, von denen unterscheiden kann, die nach hinten zeigen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Primäre Zilien beeinflussen verschiedene Signalwege. Die Cochlea von Säugetieren ist ideal für die Untersuchung der Signalübertragung der planaren Zellpolarität (PCP). Die Dysfunktion der Zilien beeinflusst das Wachstum der Cochlea, die zelluläre Musterung und die Ausrichtung der Haarzellen, die Messwerte des PCP. Unser Ziel ist es, die PCP-Signalübertragung in der Cochlea der Maus mittels phänotypischer Analyse, Immunhistochemie und Rasterelektronenmikroskopie zu analysieren.

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Vor kurzem abgebildet wir die dreidimensionale (3D) räumlichen Positionen der Transportwege für verschiedene Proteine in primäre Zilien in lebenden Zellen translocating. Hier leben diese Papier-Details, die in der Versuchsanordnung, den Prozess der biologischen Proben und der Datenanalyse für die 3D Höchstauflösung Fluoreszenz imaging Ansatz neu angewendet primäre Zilien.

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Dieses Protokoll beschreibt den Nachweis der CCL5-vermittelten periostalen Skelettstammzellmigration in Echtzeit mittels lebender tierexperimenteller Mikroskopie.

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Künstliche Intelligenz Ansätze zur Beurteilung primärer Zilien

Wir präsentieren detaillierte Protokolle für die Erzeugung und Charakterisierung von 2D- und 3D-Modellen für humane induzierte pluripotente Stammzellen (hIPSC) der neokortikalen Entwicklung sowie ergänzende Methoden, die eine qualitative und quantitative Analyse der primären Cilium (PC) -Biogenese und -Funktion ermöglichen.

2D- und 3D-humaninduzierte pluripotente Stammzell-basierte Modelle zur Sezierung der primären Ciliumbeteiligung während der neokortikalen Entwicklung

Die vorliegenden Protokolle beschreiben neuartige Whole Mount Imaging zur Visualisierung peripherer Strukturen in der Okularlinse mit Methoden zur Bildquantifizierung. Diese Protokolle können in Studien verwendet werden, um die Beziehung zwischen mikroskaligen Strukturen der Linse und der Entwicklung/Funktion der Linse besser zu verstehen.

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Hier beschreiben wir ausführlich eine Methode, die auf Mikrocomputertomographie basiert, um 3D-Modelle von kraniomaxillofazialen Knochen bei Mäusen zu segmentieren und zu vermessen, um die Entwicklung des kraniomaxillofazialen Knochens bei Mäusen besser beurteilen zu können, als dies mit aktuellen Methoden möglich ist.

Analyse von kraniomaxillofazialen Fehlbildungen bei Mäusen mittels dreidimensionaler Mikrocomputertomographie

Lernen Sie die dreidimensionale Bildgebung primärer Zilien im Wachstumsplattenknorpel mit dem transgenen Mausmodell ARL13B-CENTRIN-2. Diese Methode ermöglicht präzise Analysen zur Morphogenese.

Volumetrische Bildgebung und Analyse von primären Zilien im Muskel-Skelett-Gewebe mit dem Mausmodell ARL13B-CENTRIN-2

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