Dreidimensionales In-vitro-Differenzierungsprotokoll für kraniale Neuralleistenzellen für Multiplex-Assays

Wir sind daran interessiert zu verstehen, wie bestimmte Entscheidungen während der Entwicklung geregelt werden. Organoide Modelle und Single-Cellomics-Technologien ermöglichen es uns, Fragen zu stellen, die vorher nicht möglich waren. Die Verwendung von in vitro Organoid-Modellen ermöglicht es uns, größere Datenmengen zu generieren, insbesondere für transiente Zellpopulationen, wie z.B. die Neuralleiste.

Die Ergebnisse des Modells mit signifikanter Variabilität stellen nach wie vor eine große experimentelle Herausforderung dar. Wir haben gezeigt, dass Schädelkammzellen Präpotenzgene neu exprimieren, um das Differenzierungspotenzial zu erweitern. Bereiten Sie zunächst eine frische Kollagenaselösung mit einer Konzentration von zwei Milligramm pro Milliliter im DMEM-Knockout-Medium vor.

Aspirieren Sie das ESC-Medium aus der Well-Platte, die 70 bis 80 % konfluenten mESC enthält. Geben Sie nun vorsichtig einen Milliliter PBS an die Seite der Vertiefung. Schaukeln Sie die Platte, um eine gleichmäßige Reinigung zu gewährleisten.

Pipettieren Sie das PBS heraus und ersetzen Sie es durch zwei Milliliter Kollagenaselösung. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für 30 bis 45 Minuten. Überprüfen Sie die Platte unter einem Lichtmikroskop bei 10-facher Vergrößerung nach 20 Minuten Inkubation und dann alle fünf Minuten.

Wenn die Völker aufgerollte Ränder aufweisen, klopfen Sie kräftig auf die Plattenseite, um die Völker zu lösen. Sammeln Sie mit einer serologischen Fünf-Milliliter-Pipette die abgelösten Kolonien und geben Sie sie in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Die Kolonien werden bei 16 g drei Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert.

Saugen Sie so viel Medium wie möglich aus dem konischen Rohr ab, ohne die Kolonien am Boden zu stören. Als nächstes fügen Sie dem Pellet einen Milliliter 0,05%ige Trypsinlösung hinzu und inkubieren. Pipettieren Sie die Suspension mit einer P1000- und P200-Mikropipette kräftig auf und ab, um die Kolonien zu dissoziieren, und fügen Sie dann zwei Milliliter mESC-Kulturmedium hinzu, um das Trypsin zu blockieren.

Das Röhrchen wird bei 160 g drei Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Pipettieren Sie den Überstand aus und fügen Sie dann einen Milliliter CNCC-Differenzierungsmedium hinzu. Zählen Sie die Zellen mit einem automatischen Zellzählgerät oder unter einem Mikroskop und verdünnen Sie die Zellen dann in CNCC-Differenzierungsmedium, um eine Konzentration von 3.000 lebenden Zellen pro 50 Mikroliter zu erreichen.

Mit einer P200-Mikropipette werden 50 Mikroliter der Zellsuspension in jede Vertiefung einer nicht TC-behandelten 96-Well-Platte mit U-Boden gesät. Jede Vertiefung auf 200 Mikroliter mit CNCC-Differenzierungsmedium auffüllen und inkubieren. Beobachten Sie die Platte mit der 24-Stunden-Kultur differenzierter Zellen unter einem Lichtmikroskop, um sicherzustellen, dass kleine Cluster mit klaren Rändern am Boden jeder Vertiefung sichtbar sind.

Legen Sie die Platte über Nacht wieder in den Inkubator. Entfernen Sie am zweiten Tag langsam 100 Mikroliter Medium aus jeder Vertiefung. Verwenden Sie dann eine P200-Mikropipette, deren Spitze drei bis vier Millimeter vom Ende entfernt abgeschnitten ist, um die Neurosphären zusammen mit dem restlichen Medium zu aspirieren.

Übertragen Sie die Neurosphären und das restliche Medium in eine nicht TC-behandelte 96-Well-Platte mit flachem Boden. Überprüfen Sie die Übertragung unter einem Lichtmikroskop. Jede Vertiefung auf 200 Mikroliter vorgewärmtes CNCC-Differenzierungsmedium auffüllen.

Saugen Sie am vierten Tag 100 Mikroliter Medium aus jeder Vertiefung an. Ersetzen Sie es durch 100 Mikroliter vorgewärmtes CNCC-Differenzierungsmedium und inkubieren Sie es erneut. Überprüfen Sie an den Tagen fünf und sechs die Anhaftung der Neurosphären unter einem Lichtmikroskop.

Stellen Sie sicher, dass leichtere Zellen, die sich von den Neurosphären ablösen, beginnen, ihren Hauptkörper zu umgeben. Bereiten Sie das CNCC-Wartungsmedium gemäß der angegebenen Zusammensetzung vor. Filtrieren Sie Rinderserumalbumin durch einen 0,22-Mikrometer-Filter, bevor Sie es dem Medium zusetzen.

Sobald Wachstumsfaktoren hinzugefügt wurden, lagern Sie das Medium bis zu drei Wochen bei vier Grad Celsius, um es vor Licht zu schützen. Geben Sie 100 Mikroliter Fibronektinlösung in jede Vertiefung einer nicht TC-behandelten 96-Well-Platte. Während die Platte ruht, so viel CNCC-Differenzierungsmedium wie möglich aus den Vertiefungen der nicht TC-behandelten 96-Well-Platte mit flachem Boden ansaugen.

Ersetzen Sie das Medium durch 50 Mikroliter Accutase. Inkubieren Sie fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Geben Sie anschließend 100 Mikroliter CNCC-Erhaltungsmedium in jede Vertiefung, um die Accutase zu löschen.

Entfernen Sie Fibronektin aus den beschichteten Vertiefungen der Aufnahmeplatte. dann filtrieren Sie das abgelöste postmigratorische CNCC durch einen 40-Mikrometer-Filter in die Vertiefungen der Empfangsplatte. Verwenden Sie zum gewünschten Zeitpunkt eine P200-Mikropipette mit abgeschnittener Spitze, um Neurosphären von der 96-Well-Platte in ein Zwei-Milliliter-Röhrchen mit geringer DNA-Bindung zu übertragen.

Nachdem Sie die Neurosphären drei Minuten lang bei Raumtemperatur im Röhrchen abgesetzt haben, pipettieren Sie so viel Medium wie möglich heraus und spülen Sie es dann mit einem Milliliter kaltem PBS aus. Um die Montagekammern vorzubereiten, legen Sie drei Schichten doppelseitiges transparentes faserloses Klebeband auf einen Objektträger. Schneide mit einem Rasiermesser ein drei mal acht Millimeter großes Fenster in das doppelseitige Klebeband.

Pipettieren Sie unter einem Stereoskop mit einer P200-Schnittspitze die Neurosphären im Clearingmittel vorsichtig in die Einbettkammer. Verwenden Sie Vergrößerungen zwischen 2X und 4X, um ein Sichtfeld der gesamten Kammer zu erhalten und die Neurosphären zu identifizieren. Legen Sie einen Deckglas auf die Kammeroberfläche und drücken Sie leicht auf die Seiten, um es zu verkleben.

Neurosphärenkulturen in Nicht-Gewebeplatten zeigten ab dem fünften Tag einheitliche Attachments, während Petrischalekulturen eine variable Bindung und Fusion von Neurosphären zeigten, was besonders am vierten Tag deutlich wurde. Die Größenvariabilität der Neurosphären war in 96-Well-Plattenkulturen im Vergleich zu Petrischalekulturen an den Tagen vier und sieben signifikant reduziert. Der Durchmesser der Neurosphären in 96-Well-Platten reichte von 139 Mikrometern bis 295 Mikrometern am vierten Tag und von 383 Mikrometern bis 552 Mikrometern am siebten Tag, während Petrischale-Kulturen einen größeren Bereich aufwiesen.

Das Wachstum der Neurosphären war exponentiell in Bezug auf die Zellzahl und stieg von durchschnittlich 1.082 Zellen am zweiten Tag auf 48.352 Zellen am neunten Tag. Das Durchmesserwachstum verlief linear und stieg von durchschnittlich 136 Mikrometern am zweiten Tag auf 570 Mikrometer am neunten Tag. Immunfluoreszenzanalysen bestätigten, dass Neurosphären und delaminierende Zellen an den Tagen neun und 13 die CNCC-Marker AP2 alpha und SOX9 sowie den EMT-Marker TWIST1 exprimieren.

PAX7 war nur in den Neurosphären vorhanden.