Name: Charakterisierung extrazellulärer Vesikel aus biologischen Flüssigkeiten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-28T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 7 s
Description: Erfahren Sie die Charakterisierung extrazellulärer Vesikel aus biologischen Flüssigkeiten wie Tränen mittels Tetraspanin-Chip. Diese Methode ermöglicht die Analyse kleiner Probenmengen für nicht-invasive Biomarker-Forschung.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<table><tbody><tr><td>ChipWasher 100</td><td>NanoView</td><td>EV-CW100</td><td>Inkubiert, wäscht, spült und trocknet die Tetraspanin-Chips. Dieses aktuelle Modell ist nicht mehr erhältlich. Preis zum Zeitpunkt des Kaufs: 9.995,00 $&nbsp;</td></tr><tr><td>ExoView Analyzer Software</td><td>NanoView</td><td>N/A</td><td>Analysiert die Chipinformationen und erstellt Excel-Dateien für die weitere Analyse. Nicht mehr erhältlich.</td></tr><tr><td>ExoView R100</td><td>NanoView</td><td>EV-R100</td><td>Zum Scannen von Tetraspanin-Chips bei 3 Wellenlängen. Dieses aktuelle Modell ist nicht mehr erhältlich. Preis zum Zeitpunkt des Kaufs:&nbsp; $110,000.00</td></tr><tr><td>ExoView Scanner Software</td><td>NanoView</td><td>N/A</td><td>Scannt die Chips bei 3 verschiedenen Wellenlängen. Nicht mehr erhältlich.</td></tr><tr><td>Humane Tetraspanin-Kits</td><td>Unchained Labs</td><td>EV-TETRA-C</td><td>Enthält 8 Tetraspanin-Chips, Inkubationslösung, Blockierungslösung, CD63-Antikörper, CD81-Antikörper, CD9-Antikörper, Lösung A, Lösung B, USB und Plattenabdeckung.</td></tr></tbody></table>

charakterisierung extrazellulärer vesikel aus biologischen flüssigkeiten

Characterizing Extracellular Vesicles from Biological Fluids

Bei der Analyse der Flecken auf den Chips ist eine optimale Konzentration von EVs zu erreichen, indem fluoreszenzmarkierte EVs in den Kanälen CD63, CD81 und CD9 beobachtet werden, wobei der MIgG-Kanal 30,91 schwarz bleiben sollte, da dies der Kontrollkanal ist, wie in Abbildung 3A zu sehen ist. CD81 wird für biologische Flüssigkeiten reduziert. Wenn in den Kanälen CD63, CD81 und CD9 keine Fluoreszenz vorhanden ist, fehlen EVs (Abbildung 3B). Achten Sie darauf, den Chip nicht zu übersättigen (Abbildung 3C). Dies wird es für die Analysesoftware schwierig machen, die Genauigkeit der Größe, der Gesamtpartikelzahl und der Phänotypen der EVs zu berechnen. Ausgehend von den Punkten mit der optimalen Konzentration kann die Analysesoftware die Größe (50-200 nm), die Gesamtpartikelzahl und die Tetraspanin-Expression der EVs messen (Abbildung 4) und zur weiteren Analyse in einzelne Tabellenkalkulationen exportiert werden. Die Tetraspanin-Analyse wird die Kolokalisation der Oberflächenproteine auf den EVs beinhalten. Die Kolokalisierung wird mit einem "/" dargestellt, z. B. "CD63/CD81". Dies bedeutet nicht, dass CD63 und CD81 kombiniert werden; Das bedeutet, dass sich sowohl CD63 als auch CD81 auf der Oberfläche des Elektrofahrzeugs befinden.
Diese Ergebnisse werden wertvolle Erkenntnisse zwischen gesunden und kranken Proben liefern. Wir werden in der Lage sein festzustellen, ob gesunde oder kranke Proben mehr EVs, größere oder kleinere EVs produzieren und welchen Phänotyp die EVs haben. Jedes oder alle diese Merkmale könnten eine Rolle bei der Biogenese und/oder dem Fortschreiten der Krankheit spielen. Mit diesen Ergebnissen werden wir in der Lage sein, zu sehen, ob es ein Fehlen oder einen Anstieg der Tetraspanin-Spiegel gibt, was Aufschluss über Zellprozesse und die Bildung von EVs geben kann.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67699/67699fig1.jpg"> 
Abbildung 1: Die Typen und Größen der verschiedenen Elektrofahrzeuge. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67699/67699fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67699/67699fig2.jpg"> 
Abbildung 2: Schematische Darstellung der Art und Weise, wie die Tetraspanin-Chips EVs erfassen und detektieren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67699/67699fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67699/67699fig3.jpg"> 
Abbildung 3: Optimierung der EV-Konzentrationen. (A) Optimale Konzentration von EVs. (B) Negatives Ergebnis: keine Elektrofahrzeuge vorhanden. (C) Übersättigung mit Elektrofahrzeugen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67699/67699fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67699/67699fig4.jpg"> 
Abbildung 4: Vom Nanopartikel-Analysator erzeugte Daten. (A) EV-Durchmessergröße, gemessen in Nanometern. (B) Gesamtpartikelzahl von Elektrofahrzeugen. (C) EV-kolokalisierter Phänotyp. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67699/67699fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Technik</td>
			<td>Vorteile</td>
			<td>Begrenzungen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrazentrifuge</td>
			<td>Hohe Reinheit42,43</td>
			<td>Veränderungen der EV-Morphologie42,44</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Homogenität42,45</td>
			<td>Erfordert großes Volumen42,44,46</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Funktionalität42,43</td>
			<td>teuer42,43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durchflusszytometrie</td>
			<td>Auswertung von Proben zu mehreren Zeitpunkten47</td>
			<td>Schwaches Signal48,49</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Mehrere Endpunkte47,50</td>
			<td>Verstopfte Poren51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Einzel-EV-Analyse mit hohem Durchsatz52,53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichtegradienten-Zentrifugation</td>
			<td>Herstellung hochreiner Proben54</td>
			<td>Arbeitsintensiv55,56</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Vielzahl von Proben55,57</td>
			<td>zeitaufwändig55,58 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Erheblicher Ertragsverlust54</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Niederschlag</td>
			<td>Einfach59,60</td>
			<td>Verschmutzung36,44,61</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Schnell61,62</td>
			<td>Nicht spezifisch63</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Hohe Rendite44,59,62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Neutraler pH-Wert36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtrierung</td>
			<td>Einfach64 </td>
			<td>Fallen-Exosomen65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Schnell64</td>
			<td>Schädigt große Vesikel36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Preiswert64</td>
			<td>Kuchen filtern66,67</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Verstopfung von Exosomen65</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 1: Vorteile und Grenzen von EV-Isolationstechniken. Eine Liste der verschiedenen Möglichkeiten zur Isolierung von Elektrofahrzeugen, einschließlich ihrer Vor- und Nachteile.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Technik</td>
			<td>Vorteile</td>
			<td>Begrenzungen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamische Lichtstreuung</td>
			<td>Messung von Partikeln mit einer Größe von 1 nm bis 6 μM78 </td>
			<td>Nicht geeignet für die Messung komplexer Exosomenproben mit großem Größenbereich79 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Die untere Grenze liegt bei 10 nm, geeignet für monodisperse Systeme79 </td>
			<td>Nicht in der Lage, kontaminierte Proteine von Exosomen zu unterscheiden79</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)</td>
			<td>Morphologie der Exosomenbeobachten 79,80 </td>
			<td>Komplizierte Probenvorbereitung79 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Innere Strukturbeachten 81 </td>
			<td>Nicht in der Lage, Exosomen anhand von Größe und Form zu unterscheiden, da die Fluoreszenzsignale übertrieben sind82 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analyse der Nanopartikel-Verfolgung</td>
			<td>Messung von Konzentration, Größe und Größenverteilung von Exosomen im Bereich von 10 nm bis 2 μM78 </td>
			<td>Kann die EVs nicht von Proteinaggregaten und anderen Kontaminanten unterscheiden83 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2"></td>
			<td>Schnelle Probenvorbereitung und -messung78,84</td>
			<td>Teures NTA-Instrument85 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proben können in nativer Form zurückgewonnen werden84 </td>
			<td>Empfindlich gegen Vibrationen85</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western-Blot (WBs)</td>
			<td>kann Markerproteine qualitativ und quantitativ analysieren79,86 </td>
			<td>Kompliziert und zeitaufwändig79 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Analyse von Exosomen aus Zellkulturmedien79 </td>
			<td>EV-Isolate können Lipoproteine und andere Kontaminanten enthalten86 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Durchflusszytometrie</td>
			<td>Höhere Empfindlichkeit und hochauflösende Bildgebung für</td>
			<td rowspan="2">Zeit- und aufwändig mit Nachweisgrenze von 400 nm79,88 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unterscheidung von gefärbten Exosomen von Containments87 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Erforderliche niedrige Probenkonzentration79 </td>
			<td>Optische Signale beeinträchtigen die Genauigkeit und Auflösung88 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exoview (Englisch)</td>
			<td>Messung von Tetraspaninen (CD9, CD63 und CD81) an Exosomen89 </td>
			<td>Misst keine größeren EV-Größen75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Misst EV-Frachtproteine90</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 2: Vorteile und Grenzen von EV-Charakterisierungstechniken.

Charakterisierung extrazellulärer Vesikel aus biologischen Flüssigkeiten

Extracellular vesicles (EVs) are structures that are produced from cells and participate in intercellular communication by transporting biomolecules from ...

Extrazelluläre Vesikel dienen als Biomarker für Krankheiten, die physiologische Zustände widerspiegeln. Unser Ansatz ermöglicht die Extraktion reichhaltiger Daten aus winzigen Tränenvolumina und treibt die EV-Forschung in biologischen Flüssigkeiten voran. Zu den wichtigsten experimentellen Herausforderungen gehören die Erzielung ausreichender extrazellulärer Vesikelkonzentrationen aus kleinen Proben, die Minimierung von Probenverlusten während der Isolierung und die Optimierung der Analyse, um eine Chip-Übersättigung oder eine schwache Signalerkennung zu verhindern.Dieses Protokoll umgeht Isolationsschritte, reduziert die Verarbeitungszeit und ermöglicht die Analyse extrazellulärer Vesikel aus kleinen Probenvolumina, was es ideal für begrenzte biologische Proben wie Tränen macht. Nicht-invasive Biomarker sind entscheidend für die Früherkennung und Behandlung von Hornhauterkrankungen. Extrazelluläre Vesikel-Biomarker ermöglichen die Überwachung von Krankheiten, personalisierte Behandlungen, eine bessere Compliance der Patienten und eine verbesserte Lebensqualität.Unser Labor leistete Pionierarbeit bei der Analyse extrazellulärer Vesikel in Tränenproben von KC-Probanden und identifizierte einzigartige tEV-Signaturen. Dies ebnet den Weg für zukünftige Diagnostika und EV-fokussierte therapeutische Ziele. Legen Sie zunächst die biologischen Proben und einen Tetraspanin-Chip auf den Arbeitsbereich.Pipettieren Sie 70 Mikroliter humanbiologischer Proben, die mit Lösung B eines humanen Tetraspanin-Kits vorgemischt wurden, auf einen Chip. Legen Sie die Folie auf eine Chipwaschplatte, um eine Verdunstung der Probe zu verhindern. Nach 16 Stunden legen Sie die Platte in die Spänewaschanlage.Verriegeln Sie es und schließen Sie den Deckel. Drücken Sie die Option CW-TETRA v0 an der Chipwaschanlage. Während die Chips gewaschen werden, bereiten Sie 300 Mikroliter Blockierlösung pro Chip vor.Geben Sie 0,6 Mikroliter jedes Antikörpers pro Chip in die Blockierungslösung. Die Blockierungslösung mit dem Antikörpercocktail aufreiben, um eine gründliche Durchmischung zu gewährleisten. Wenn die Chipwäsche abgeschlossen ist, fügen Sie 250 Mikroliter der Blockierungslösung mit dem Antikörpercocktail auf jeden Chip hinzu.Schließen Sie dann den Deckel und drücken Sie Weiter. Wenn der Spänewascher zwitschert, entfernen Sie die Spänewaschplatte. Bewege die Chips die Rampe hinauf.Setzen Sie die Platte wieder in die Spänewaschanlage ein und stellen Sie sicher, dass sie sicher einrastet. Schließen Sie den Deckel und drücken Sie Weiter. Schalten Sie zunächst einen Nanopartikel-Analysator ein.Starten Sie die Scan-Software auf dem Desktop, der mit dem Nanopartikel-Analysator verbunden ist. Wählen Sie den Chipordner aus, um jeden Tetraspanin-Chip auszuwählen, und platzieren Sie ihn in der Chipposition auf dem Spannfutter. Klicken Sie auf die drei Quadrate unter der Chip-Position, um die Fluoreszenz einzuschalten.Die Quadrate werden gelb, blau und rot. Drücken Sie auf den Futterdeckel und ziehen Sie daran, um ihn zu entfernen. Befestigen Sie dann die mit Proben beladenen Tetraspanin-Chips fest auf dem Futter.Richten Sie die Stifte des Futterdeckels an den Löchern aus und drücken Sie sie nach unten. Schieben Sie den Deckel auf, um ihn zu verriegeln. Platzieren Sie dann das Bohrfutter auf der Bühne und arretieren Sie es.Klicken Sie anschließend in der Softwareoberfläche auf Scan Chips und dann auf OK. Sobald sich der Tisch vollständig in die Maschine einfährt, schließen Sie die Tür. Wenn der Scan abgeschlossen ist, öffnen Sie die Klappe, um den Tisch auszuwerfen und die Ergebnisse zu überprüfen. Wenn die Scans erfolgreich waren, entsorgen Sie die Chips.Lege den nächsten Satz Späne auf das Futter. Alternativ können Sie das leere Spannfutter wieder auf die Bühne stellen. Beenden Sie die Software und schalten Sie das Gerät aus, wenn Sie fertig sind.Optimale Fluoreszenzniveaus extrazellulärer Vesikel wurden in den CD63-, CD81- und CD9-Kanälen beobachtet, während der MIgG-Kontrollkanal schwarz blieb, was die Kontrollspezifität bestätigt. CD81 wurde für biologische Flüssigkeiten reduziert. Keine Fluoreszenz in den CD63-, CD81- und CD9-Kanälen deutet auf das Fehlen extrazellulärer Vesikel hin.Eine Übersättigung der Fluoreszenz war offensichtlich, was es schwierig machte, aussagekräftige Daten aufgrund der übermäßigen Markierung, insbesondere in den CD63-, CD81- und CD9-Kanälen, zu erkennen.

characterizing-extracellular-vesicles-from-biological-fluids

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Extrazelluläre Vesikel im Blut wurden als neuartige Biomarker für verschiedene Krankheiten vorgeschlagen. In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll für die Isolierung von großen Mikrovesikeln aus Plasmamembranen aus peripheren Blutproben und deren anschließende Analyse mittels konventioneller Durchflusszytometrie und Western Blotting vor.

Isolierung und Charakterisierung von Mikrovesikeln aus peripherem Blut

In diesem Protokoll beschreiben wir den kompletten Workflow für die schnelle Isolierung von extrazellulären Vesikeln aus menschlichen Vollblut und Charakterisierung spezifischer Marker durch Fluoreszenz-basierte Nanopartikel-Tracking-Analyse. Die vorgestellten Ergebnisse zeigen ein hohes Maß an Reproduzierbarkeit und Zelle Kultur Überstände angepasst werden können.

Rasche Fluoreszenz basierende Charakterisierung der einzelnen extrazelluläre Vesikel im menschlichen Blut mit Nanopartikel-Tracking Analyse

Das Protokoll beschreibt eine reproduzierbare Methode zur Verwendung mit Zelle Kultur Überstände, Oberfläche Epitope auf kleine extrazelluläre Vesikel (EV) zu erkennen. Es nutzt spezifische EV Immunopräzipitation mit Perlen mit Antikörpern, die Oberflächenantigen CD9, erkennen CD63 und CD81 gekoppelt. Die Methode ist für nachgeschaltete Flow Cytometry Analyse optimiert.

Fließen Sie durchflusszytometrischen Analyse der extrazellulären Vesikel aus Zelle konditioniertes Medien

Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll um kleine extrazelluläre Vesikel (EVs) aus dem ganzen Gewebe, einschließlich Gehirn und Tumor Proben zu isolieren. Diese Methode bietet eine reproduzierbare Technik um EVs aus festen Gewebe für weitere nachgelagerte Analysen zu extrahieren.

Gewinnung von extrazellulären Vesikel aus ganze Gewebe

Der vorliegende Bericht hebt die chronologischen Anforderungen an die extrazelluläre Vesikel-Isolierung (EV) von Mikroglia oder Blutmakrophagen hervor. Mikroglia-abgeleitete Elektrofahrzeuge wurden als Regulatoren des Neuritenwachstums evaluiert, während von Blutmakrophagen abgeleitete Elektrofahrzeuge bei der Kontrolle der C6-Gliomzellinvasion in In-vitro-Assays untersucht wurden. Ziel ist es, diese EV-Funktionen als Immunvermittler in bestimmten Mikroumgebungen besser zu verstehen.

Charakterisierung von immunzellulären Vesikeln und Untersuchung der funktionellen Auswirkungen auf die Zellumgebung

Das Protokoll zeigt hier, dass extrazelluläre Vesikel mittels Größenausschlusschromatographie adäquat von konditionierten Zellkulturmedien getrennt werden können.

Größenausschlusschromatographie zur Trennung extrazellulärer Vesikel aus konditionierten Zellkulturmedien

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode zur Extraktion extrazellulärer Vesikel aus dem peripheren Blut und festem Gewebe mit anschließender Profilierung von Oberflächenantigenen und Proteinladungen.

Isolierung und Analyse von nachweisbaren und funktionalisierten extrazellulären Vesikeln aus dem Plasma und festen Geweben

Die neueste Generation von EV-Charakterisierungswerkzeugen ist in der Lage, eine einzelne EV-Analyse über mehrere Parameter gleichzeitig durchzuführen. Die Nano-Durchflusszytometrie misst alle biologischen Partikel größer als 45 nm ohne Markierung und identifiziert spezifische Eigenschaften von Subpopulationen durch eine Vielzahl von fluoreszierenden Markierungstechniken.

Charakterisierung einzelner extrazellulärer Vesikel-Transmembranproteine mittels Nano-Durchflusszytometrie

Dieser Artikel beschreibt eine Methodik zur Isolierung, Charakterisierung und Quantifizierung von extrazellulären Vesikeln (EV) aus humanem Plasma und stellt einen Arbeitsablauf für die markierungsfreie Analyse des EV-Proteoms mittels Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) vor.

Isolierung, Charakterisierung und proteomische Analyse von aus Plasma gewonnenen extrazellulären Vesikeln zur Entdeckung kardiovaskulärer Biomarker

Dieses Protokoll bietet eine detaillierte Beschreibung der Sortierung extrazellulärer Vesikel (EVs), die von mesenchymalen Stromazellen freigesetzt werden. Dabei geht es insbesondere um die Geräteeinstellung und die Optimierung der Sortierbedingungen. Ziel ist es, extrazelluläre Vesikel zu sortieren und dabei ihre Eigenschaften zu erhalten.

Festlegen einer erfolgreichen Sortierung für die Isolierung extrazellulärer Vesikel

Erfahren Sie die Charakterisierung extrazellulärer Vesikel aus biologischen Flüssigkeiten wie Tränen mittels Tetraspanin-Chip. Diese Methode ermöglicht die Analyse kleiner Probenmengen für nicht-invasive Biomarker-Forschung.

Charakterisierung extrazellulärer Vesikel aus biologischen Flüssigkeiten

Weitere Videos entdecken