Charakterisierung extrazellulärer Vesikel aus biologischen Flüssigkeiten
February 28th, 2025
Hier demonstrieren wir die Charakterisierungsmethode für extrazelluläre Vesikel (EVs), die aus biologischen Flüssigkeiten wie Tränen und Speichel von menschlichen Probanden gewonnen wurden. Der bei dieser Methode verwendete Scanner ist in der Lage, den Phänotyp, die Größe und die Gesamtpartikelzahl von EVs aus 1 μl der Probe zu erkennen.
Extrazelluläre Vesikel dienen als Biomarker für Krankheiten, die physiologische Zustände widerspiegeln. Unser Ansatz ermöglicht die Extraktion reichhaltiger Daten aus winzigen Tränenvolumina und treibt die EV-Forschung in biologischen Flüssigkeiten voran. Zu den wichtigsten experimentellen Herausforderungen gehören die Erzielung ausreichender extrazellulärer Vesikelkonzentrationen aus kleinen Proben, die Minimierung von Probenverlusten während der Isolierung und die Optimierung der Analyse, um eine Chip-Übersättigung oder eine schwache Signalerkennung zu verhindern.
Dieses Protokoll umgeht Isolationsschritte, reduziert die Verarbeitungszeit und ermöglicht die Analyse extrazellulärer Vesikel aus kleinen Probenvolumina, was es ideal für begrenzte biologische Proben wie Tränen macht. Nicht-invasive Biomarker sind entscheidend für die Früherkennung und Behandlung von Hornhauterkrankungen. Extrazelluläre Vesikel-Biomarker ermöglichen die Überwachung von Krankheiten, personalisierte Behandlungen, eine bessere Compliance der Patienten und eine verbesserte Lebensqualität.
Unser Labor leistete Pionierarbeit bei der Analyse extrazellulärer Vesikel in Tränenproben von KC-Probanden und identifizierte einzigartige tEV-Signaturen. Dies ebnet den Weg für zukünftige Diagnostika und EV-fokussierte therapeutische Ziele. Legen Sie zunächst die biologischen Proben und einen Tetraspanin-Chip auf den Arbeitsbereich.
Pipettieren Sie 70 Mikroliter humanbiologischer Proben, die mit Lösung B eines humanen Tetraspanin-Kits vorgemischt wurden, auf einen Chip. Legen Sie die Folie auf eine Chipwaschplatte, um eine Verdunstung der Probe zu verhindern. Nach 16 Stunden legen Sie die Platte in die Spänewaschanlage.
Verriegeln Sie es und schließen Sie den Deckel. Drücken Sie die Option CW-TETRA v0 an der Chipwaschanlage. Während die Chips gewaschen werden, bereiten Sie 300 Mikroliter Blockierlösung pro Chip vor.
Geben Sie 0,6 Mikroliter jedes Antikörpers pro Chip in die Blockierungslösung. Die Blockierungslösung mit dem Antikörpercocktail aufreiben, um eine gründliche Durchmischung zu gewährleisten. Wenn die Chipwäsche abgeschlossen ist, fügen Sie 250 Mikroliter der Blockierungslösung mit dem Antikörpercocktail auf jeden Chip hinzu.
Schließen Sie dann den Deckel und drücken Sie Weiter. Wenn der Spänewascher zwitschert, entfernen Sie die Spänewaschplatte. Bewege die Chips die Rampe hinauf.
Setzen Sie die Platte wieder in die Spänewaschanlage ein und stellen Sie sicher, dass sie sicher einrastet. Schließen Sie den Deckel und drücken Sie Weiter. Schalten Sie zunächst einen Nanopartikel-Analysator ein.
Starten Sie die Scan-Software auf dem Desktop, der mit dem Nanopartikel-Analysator verbunden ist. Wählen Sie den Chipordner aus, um jeden Tetraspanin-Chip auszuwählen, und platzieren Sie ihn in der Chipposition auf dem Spannfutter. Klicken Sie auf die drei Quadrate unter der Chip-Position, um die Fluoreszenz einzuschalten.
Die Quadrate werden gelb, blau und rot. Drücken Sie auf den Futterdeckel und ziehen Sie daran, um ihn zu entfernen. Befestigen Sie dann die mit Proben beladenen Tetraspanin-Chips fest auf dem Futter.
Richten Sie die Stifte des Futterdeckels an den Löchern aus und drücken Sie sie nach unten. Schieben Sie den Deckel auf, um ihn zu verriegeln. Platzieren Sie dann das Bohrfutter auf der Bühne und arretieren Sie es.
Klicken Sie anschließend in der Softwareoberfläche auf Scan Chips und dann auf OK. Sobald sich der Tisch vollständig in die Maschine einfährt, schließen Sie die Tür. Wenn der Scan abgeschlossen ist, öffnen Sie die Klappe, um den Tisch auszuwerfen und die Ergebnisse zu überprüfen. Wenn die Scans erfolgreich waren, entsorgen Sie die Chips.
Lege den nächsten Satz Späne auf das Futter. Alternativ können Sie das leere Spannfutter wieder auf die Bühne stellen. Beenden Sie die Software und schalten Sie das Gerät aus, wenn Sie fertig sind.
Optimale Fluoreszenzniveaus extrazellulärer Vesikel wurden in den CD63-, CD81- und CD9-Kanälen beobachtet, während der MIgG-Kontrollkanal schwarz blieb, was die Kontrollspezifität bestätigt. CD81 wurde für biologische Flüssigkeiten reduziert. Keine Fluoreszenz in den CD63-, CD81- und CD9-Kanälen deutet auf das Fehlen extrazellulärer Vesikel hin.
EineÜbersättigung der Fluoreszenz war offensichtlich, was es schwierig machte, aussagekräftige Daten aufgrund der übermäßigen Markierung, insbesondere in den CD63-, CD81- und CD9-Kanälen, zu erkennen.
Übersicht
Diese Studie präsentiert eine neuartige Methode zur Charakterisierung extrazellulärer Vesikel (EVs), die aus menschlichen biologischen Flüssigkeiten wie Tränen und Speichel gesammelt wurden. Durch die Verwendung eines Tetraspanin-Chips erleichtert der Ansatz die Analyse von EVs aus minimalen Probenvolumina und fördert die Untersuchung nicht-invasiver Biomarker für die Krankheitsüberwachung.
Wichtige Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Extrazelluläre Vesikel
- Nicht-invasive Biomarker
- Okuläre Erkrankungen
Hintergrund
- EVs dienen als Indikatoren für physiologische Zustände und Krankheiten
- Herausforderungen umfassen niedrige Konzentrationen in kleinen Proben und Probenbearbeitungszeit
- Bedeutung der Früherkennung von Hornhauterkrankungen
Verwendete Methoden
- Verwendung eines Tetraspanin-Chips für die EV-Analyse
- Humane biologische Proben (Tränen)
- Fluoreszenzbasierter Nachweis von EV-Markern CD63, CD81 und CD9
Hauptergebnisse
- Integration von Probenvorbereitung und Analyseschritten reduziert die Verarbeitungszeit
- Fluoreszenzniveaus der EV-Marker bestätigten Spezifität und Präsenz
- Identifizierung von tEV-Signaturen in Tränenproben von Keratokonus-Subjekten
Schlussfolgerungen
- Diese Methode bietet einen optimierten Ansatz für die EV-Analyse aus kleinen biologischen Proben
- Die Ergebnisse unterstützen zukünftige Diagnostik und therapeutische Ziele in der Augengesundheit
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Characterizing extracellular vesicles (EVs) from minimal biological fluid volumes addresses a critical bottleneck in non-invasive biomarker discovery and disease monitoring. This workflow enables high-content EV phenotyping from scarce patient samples, supporting translational research and early-stage target validation. The approach enhances predictive confidence for biomarker-driven portfolio decisions in ocular and systemic disease pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of EV-based biomarkers for disease-relevant pathway analysis.
- Supports functional target validation by quantifying EV phenotypes from patient-derived fluids.
- Facilitates mechanistic de-risking by linking EV signatures to physiological states.
Screening & Assay Development
- Prepares validated EV detection systems for downstream screening workflows.
- Delivers quantitative, reproducible EV marker measurements from as little as 1 μL of sample.
- Standardizes assay conditions to minimize sample loss and maximize data quality.
Translational & Preclinical Research
- Aligns non-invasive EV biomarker analysis with disease monitoring strategies.
- Enables continuity from discovery to preclinical validation using patient-derived fluids.
- Supports risk-adjusted advancement of biomarker-driven therapeutic hypotheses.
Pipeline & Workflow Integration
This EV characterization protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging early biomarker identification with translational validation in limited-sample contexts.
- Discovery Biology: Provides robust hypothesis testing for EV biomarker relevance in disease states.
- Screening: Offers reproducible, quantitative EV marker readouts for assay development.
- Analytics: Delivers particle count, size, and phenotype data to compare biological conditions.
- Translational Research: Connects non-invasive sample analysis to preclinical biomarker validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable platform for EV analysis across diverse biological fluids.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in EV biomarker discovery and target validation.
- Operational Value: Reduces sample requirements and processing time while enhancing reproducibility.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for biomarker-driven programs and reduces late-stage risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of non-invasive biomarker assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in EV biology and fluorescence-based detection systems.
- Needs access to nanoparticle analyzers and tetraspanin chip technology.
- Demands cross-team standardization for sample handling and data interpretation.
- Adaptable to various biological fluids with protocol optimization.
- Potential limitations include chip oversaturation and signal detection thresholds.
