Charakterisierung extrazellulärer Vesikel aus biologischen Flüssigkeiten

Extrazelluläre Vesikel dienen als Biomarker für Krankheiten, die physiologische Zustände widerspiegeln. Unser Ansatz ermöglicht die Extraktion reichhaltiger Daten aus winzigen Tränenvolumina und treibt die EV-Forschung in biologischen Flüssigkeiten voran. Zu den wichtigsten experimentellen Herausforderungen gehören die Erzielung ausreichender extrazellulärer Vesikelkonzentrationen aus kleinen Proben, die Minimierung von Probenverlusten während der Isolierung und die Optimierung der Analyse, um eine Chip-Übersättigung oder eine schwache Signalerkennung zu verhindern.

Dieses Protokoll umgeht Isolationsschritte, reduziert die Verarbeitungszeit und ermöglicht die Analyse extrazellulärer Vesikel aus kleinen Probenvolumina, was es ideal für begrenzte biologische Proben wie Tränen macht. Nicht-invasive Biomarker sind entscheidend für die Früherkennung und Behandlung von Hornhauterkrankungen. Extrazelluläre Vesikel-Biomarker ermöglichen die Überwachung von Krankheiten, personalisierte Behandlungen, eine bessere Compliance der Patienten und eine verbesserte Lebensqualität.

Unser Labor leistete Pionierarbeit bei der Analyse extrazellulärer Vesikel in Tränenproben von KC-Probanden und identifizierte einzigartige tEV-Signaturen. Dies ebnet den Weg für zukünftige Diagnostika und EV-fokussierte therapeutische Ziele. Legen Sie zunächst die biologischen Proben und einen Tetraspanin-Chip auf den Arbeitsbereich.

Pipettieren Sie 70 Mikroliter humanbiologischer Proben, die mit Lösung B eines humanen Tetraspanin-Kits vorgemischt wurden, auf einen Chip. Legen Sie die Folie auf eine Chipwaschplatte, um eine Verdunstung der Probe zu verhindern. Nach 16 Stunden legen Sie die Platte in die Spänewaschanlage.

Verriegeln Sie es und schließen Sie den Deckel. Drücken Sie die Option CW-TETRA v0 an der Chipwaschanlage. Während die Chips gewaschen werden, bereiten Sie 300 Mikroliter Blockierlösung pro Chip vor.

Geben Sie 0,6 Mikroliter jedes Antikörpers pro Chip in die Blockierungslösung. Die Blockierungslösung mit dem Antikörpercocktail aufreiben, um eine gründliche Durchmischung zu gewährleisten. Wenn die Chipwäsche abgeschlossen ist, fügen Sie 250 Mikroliter der Blockierungslösung mit dem Antikörpercocktail auf jeden Chip hinzu.

Schließen Sie dann den Deckel und drücken Sie Weiter. Wenn der Spänewascher zwitschert, entfernen Sie die Spänewaschplatte. Bewege die Chips die Rampe hinauf.

Setzen Sie die Platte wieder in die Spänewaschanlage ein und stellen Sie sicher, dass sie sicher einrastet. Schließen Sie den Deckel und drücken Sie Weiter. Schalten Sie zunächst einen Nanopartikel-Analysator ein.

Starten Sie die Scan-Software auf dem Desktop, der mit dem Nanopartikel-Analysator verbunden ist. Wählen Sie den Chipordner aus, um jeden Tetraspanin-Chip auszuwählen, und platzieren Sie ihn in der Chipposition auf dem Spannfutter. Klicken Sie auf die drei Quadrate unter der Chip-Position, um die Fluoreszenz einzuschalten.

Die Quadrate werden gelb, blau und rot. Drücken Sie auf den Futterdeckel und ziehen Sie daran, um ihn zu entfernen. Befestigen Sie dann die mit Proben beladenen Tetraspanin-Chips fest auf dem Futter.

Richten Sie die Stifte des Futterdeckels an den Löchern aus und drücken Sie sie nach unten. Schieben Sie den Deckel auf, um ihn zu verriegeln. Platzieren Sie dann das Bohrfutter auf der Bühne und arretieren Sie es.

Klicken Sie anschließend in der Softwareoberfläche auf Scan Chips und dann auf OK. Sobald sich der Tisch vollständig in die Maschine einfährt, schließen Sie die Tür. Wenn der Scan abgeschlossen ist, öffnen Sie die Klappe, um den Tisch auszuwerfen und die Ergebnisse zu überprüfen. Wenn die Scans erfolgreich waren, entsorgen Sie die Chips.

Lege den nächsten Satz Späne auf das Futter. Alternativ können Sie das leere Spannfutter wieder auf die Bühne stellen. Beenden Sie die Software und schalten Sie das Gerät aus, wenn Sie fertig sind.

Optimale Fluoreszenzniveaus extrazellulärer Vesikel wurden in den CD63-, CD81- und CD9-Kanälen beobachtet, während der MIgG-Kontrollkanal schwarz blieb, was die Kontrollspezifität bestätigt. CD81 wurde für biologische Flüssigkeiten reduziert. Keine Fluoreszenz in den CD63-, CD81- und CD9-Kanälen deutet auf das Fehlen extrazellulärer Vesikel hin.

Übersättigung der Fluoreszenz war offensichtlich, was es schwierig machte, aussagekräftige Daten aufgrund der übermäßigen Markierung, insbesondere in den CD63-, CD81- und CD9-Kanälen, zu erkennen.