Name: Innervation menschlicher Darmorganoide (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-17T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Erfahren Sie die Innervation menschlicher Darmorganoide zur Optimierung des enterischen Nervensystems. Diese Methode unterstützt die Entwicklung bioengineerter Lösungen für Kinder mit Darmversagen.

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<ol><li>Wales, P. W., Christison-Lagay, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+bowel+syndrome%3A+epidemiology+and+etiology%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Pediatr+Surg%22%5BJournal%5D)">Short bowel syndrome: epidemiology and etiology.</a> Semin Pediatr Surg. 19 (1), 3-9 (2010).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>100x Non-Essential Amino Acids Solution (NEAA)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>15 mL konische Röhrchen</td><td>Thermo Scientific</td><td>12565269</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>07920</td><td>"Reagenz zur enzymatischen Zellablösung"</td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50x), minus Vitamin A</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>12587010</td><td>für ENCC</td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50x), serumfrei</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>für HIO</td></tr><tr><td>Bright-Line Hämazytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>3120</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar Ultra-Low Attachment Mikrotiterplatten</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-601</td><td></td></tr><tr><td>Corning Flat-Bottom Plate 24-Well, TC-behandelt</td><td>VWR</td><td>29442-044</td><td></td></tr><tr><td>Corning Flat-Bottom Plate 3516 6 well</td><td>VWR</td><td>29442-042</td><td></td></tr><tr><td>Essential 6 Media</td><td>Thermo Fischer</td><td>A1516401</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8 Media</td><td>Thermo Fischer</td><td>A2858501</td><td>Alternative Stammzellmedien, die für ENCC-Platten verwendet werden.</td></tr><tr><td>Pinzette mit feiner Spitze</td><td>Dumont</td><td>11223-20</td><td></td></tr><tr><td>Forma Steri-Cycle i160</td><td>Thermo Scientific</td><td>50145522</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Advanced DMEM/F12</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>Gibco HEPES 1 M</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Neurobasales Medium</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Glutagro, 200 mM, 100x</td><td>Corning</td><td>25-015-CI</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>H9 human ESC</td><td>Wicell International Stem Cell Bank</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HyCloneTM FBS Defined</td><td>VWR</td><td>16777-002</td><td></td></tr><tr><td>LabGard Biologische Sicherheitswerkbank</td><td>Nuaire</td><td>Nu-430-400</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel GFR Basalmembranmatrix, phenolrotfrei, LDEV-frei</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>"Klare 3D-Basalmembranmatrix"</td></tr><tr><td>Matrigel hESC-qualifizierte Matrix, LDEV-frei</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>"3D Basalmembranmatrix"</td></tr><tr><td>Mikropipetten</td><td>Eppendorf (100-1000, 20-200, 10-100, 2-20, 0,5-10, 0,1-2,5 uL)</td><td>2231300008</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR 1</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85850</td><td>"Stammzellmedien" Die Katalognummer enthält die 5x Ergänzung, die im Voraus in großen Mengen hinzugefügt werden muss.&nbsp;</td></tr><tr><td>N-2 Supplement (100x)</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td>für HIO</td></tr><tr><td>N-2 Supplement, CTS (Cell Therapy Systems)</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1370701</td><td>für ENCC. Etwas andere Formulierung.</td></tr><tr><td>Nikon DS-Fi2 TS-100 Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>TS100</td><td></td></tr><tr><td>Noggin-konditioniertes Medium</td><td>Texas Medical Center Digestive Disease Center GEMS Core, Enteroid/Organoid Sub-core</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinante humane Activin A</td><td>Zellleitsysteme</td><td>GFH6-100</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes BMP-4</td><td>Fisher Scientific</td><td>314BP010</td><td></td></tr><tr><td>rekombinantes humanes EGF-Protein, CF</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>236-EG-200</td><td></td></tr><tr><td>rekombinantes humanes FGF basic/FGF2 (146 aa) Protein</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>233-FB-010</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes FGF-4</td><td>Peprotech</td><td>100-31</td><td></td></tr><tr><td>ReLeSR</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5872</td><td>"Stammzelldissoziationsreagenz"Retinsäure</td></tr> <tr><td></td><td>SIGMA</td><td>R2625-50MG</td><td></td></tr><tr><td>Rnasefreie Mikrofuge-Röhrchen, 2 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM12425</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>R-Spondin konditionierte Medien</td><td>Texas Medical Center Digestive Disease Center GEMS Core, Enteroid/Organoid Sub-Core</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>SB 431542, Tocris Bioscience</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-141-0</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall ST 16R Zentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Standard Pipettierspitzen mit breiter Öffnung</td><td>VWR</td><td>89049-166</td><td></td></tr><tr><td>Stemolecule Chir99021 in Lösung</td><td>Stemgent</td><td>04-0004-02</td><td></td></tr><tr><td>Sterilfilter-Pipettenspitzen</td><td>VWR (1000 μl, 200 μl, 10 μl)</td><td>76322-154, 76322-150, 89174-520</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectin XF</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>7180</td><td>Alternative 3D-Basalmembranmatrix, verwendet für ENCC-Platten.</td></tr></tbody></table>

innervation menschlicher darmorganoide

Innervation of Human Intestinal Organoids

Das ENS reguliert die wesentlichen Funktionen des reifen Dünndarms, einschließlich der Peristaltik, der Nährstoffaufnahme, des Flüssigkeitstransports und der Aufrechterhaltung der Epithelbarriere. Das Ziel der Innervation von HIOs besteht also darin, diese Konstrukte mit den Elementen zu versorgen, die sie benötigen, um ausgereiftere, übergeordnete Funktionen zu entwickeln. Zu diesem Zweck untersucht unser Labor speziell die Entwicklung des ENS innerhalb von HIOs sowie die funktionellen Ergebnisse in verschiedenen Phasen...

Innervation menschlicher Darmorganoide

The complexity of intestinal cytoarchitecture and function poses significant challenges for the creation of the bioengineered small intestine. Techniques ...

Unsere Forschung konzentriert sich auf die Erzeugung von Tissue Engineering Darm als Lösung für das Kurzdarmsyndrom. Unser Labor konzentriert sich auf die Optimierung der Integration eines enterischen Nervensystems und die Optimierung der räumlichen Organisation, der zellulären Vielfalt und der Funktion. Wir hoffen, dass wir eines Tages eine lebensverändernde Lösung für Kinder mit Darmversagen schaffen können, indem wir biotechnologisch hergestellten Darm herstellen.Die Innervation menschlicher Darmorganoide erfordert die Nachahmung der menschlichen Darmentwicklung, und dies kann eine Herausforderung darstellen. Die Entwicklung des enterischen Nervensystems erfordert sowohl biochemische Signale als auch biomechanische Kräfte. Die zukünftigen Studien unseres Labors konzentrieren sich auf die Optimierung der Entwicklung des enterischen Nervensystems bei menschlichen Darmorganoiden.Wir untersuchen sowohl die räumliche Organisation als auch die zelluläre Vielfalt und haben kürzlich eine neuartige 3D-Bildgebungstechnik verwendet, die von Dr. Herath entwickelt wurde und die ENS in unseren Darmorganoiden robust charakterisieren und quantifizieren kann. Dies wird uns helfen, unser Modell zu verfeinern und die Entwicklung und Funktion des menschlichen Darms zu rekapitulieren. Nehmen Sie zunächst die Platte mit kultivierten enterischen Neuralleistenzellen oder ENCC-Sphäroiden der Tage 15 bis 21 und entfernen Sie das Medium vorsichtig aus der Vertiefung.Geben Sie einen Milliliter eines warmen enzymatischen Zellablösungsreagenzes in die Vertiefung und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Tippen Sie dann auf die Seite der Platte, um die Sphäroiddissoziation zu erleichtern. Titrieren Sie die Mischung mit einer P1000-Mikropipette mit Weithalsspitze, indem Sie sie vorsichtig auf und ab pipettieren, bis die Zellen homogen sind.Die ENCC-Suspension wird in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen überführt. Waschen Sie die Vertiefung mit einem Milliliter warmem Neuralleisten-Zellmedium, um alle verbleibenden Zellen zu sammeln, und geben Sie diese dann in das konische Rohr. Zentrifugieren Sie nun die Zellsuspension bei 300 G für eine Minute.Aspirieren Sie dann den Überstand mit einer sterilen Pipettenspitze. Anschließend wird das Zellpellet mit einer Weithalspipettenspitze in einem Milliliter warmem Neuralleisten-Zellmedium resuspendiert. Sammeln Sie die kultivierten Sphäroide des mittleren Hinterdarms mit einer Weithalspipettenspitze aus allen Vertiefungen einer menschlichen Darmorganoidplatte und geben Sie sie in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen.Das berechnete Volumen der ENCC-Suspension wird in das konische Röhrchen gegeben, das die Sphäroide des mittleren Hinterdarms enthält. Tritieren Sie die Mischung vorsichtig mit einer Weithalspipettenspitze, um die Sphäroide und ENCCs gleichmäßig zu mischen. Die kombinierte Zellsuspension wird eine Minute lang bei 300 g zentrifugiert.Saugen Sie den Überstand vorsichtig mit einer sterilen Pipettenspitze ab. Dann resuspendieren Sie das resultierende Zellpellet in einer kalten phenolfreien Wachstumsfaktor-reduzierten Basalmembranmatrix. Pipettieren Sie als Nächstes die 30-Mikroliter-Tröpfchen der resuspendierten Sphäroide und ENCCs im mittleren Hinterdarm in der klaren Basalmembranmatrix in die Mitte jeder trockenen Vertiefung.Sobald alle Tröpfchen plattiert sind, decken Sie die Platte ab, drehen Sie sie um und legen Sie sie 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid in einen Inkubator. Am Tag Null, sobald die klare Basalmembranmatrix polymerisiert ist, bedecken Sie jedes Tröpfchen mit 500 Mikrolitern warmem Tag Null bis drei HIO-Medien. Saugen Sie am dritten Tag das HIO-Medium von Tag Null bis drei vorsichtig von der Seite jeder Vertiefung an, ohne das klare Tröpfchen der Basalmembranmatrix zu stören.Ersetzen Sie es durch 500 Mikroliter warmes Tagesmedium drei bis 14 HIO-Medien und stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator. Untersuchen Sie an Tag 14 jede Vertiefung unter einem Mikroskop, um die Anzahl der sich entwickelnden HIO+ENS-Strukturen in jedem Tröpfchen der klaren 3D-Basalmembranmatrix zu bestimmen. Geben Sie 30 Mikroliter klare Basalmembranmatrix in Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und halten Sie sie auf Eis.Entfernen Sie unter einer Laminar-Flow-Haube mit einer feinen Pinzette vorsichtig das klare Tröpfchen der Basalmembranmatrix, das das suspendierte HIO+ENS enthält. Ziehen Sie einzelne HIO+ENS-Strukturen mit der Pinzette sanft auseinander. Legen Sie jede isolierte HIO+ENS-Struktur mit einer feinen Pinzette oder einer Weithalspipettenspitze in die Mikrozentrifugenröhrchen mit 30 Mikrolitern klarer Basalmembranmatrix.Pipettieren Sie dann einen 30-Mikroliter-Tropfen des resuspendierten HIO+ENS in einer klaren Basalmembranmatrix in die Mitte jeder trockenen Vertiefung. Sobald die Tröpfchen polymerisiert sind, geben Sie 500 Mikroliter warmes, frisches Medium vom dritten Tag bis 14 HIO+ENS in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte über Nacht. Saugen Sie an Tag 15 das Medium der Tage drei bis 14 vorsichtig von der Seite jeder Vertiefung an, ohne das polymerisierte Tröpfchen zu stören.Ersetzen Sie das Medium durch 500 Mikroliter 15 bis 28 HIO+ENS-Medien für den warmen Tag. Die HIO-ENS-Kokultur zeigte ein signifikantes Wachstum mit der Entwicklung mesenchymaler Strukturen, die dünne, trübe Fortsätze bildeten und am 30. Tag eine haloartige Grenze um die epithelialen Involutionen bildeten. ENCCs wanderten in Richtung der HIOs, waren in das Mesenchym integriert und überlebten in vitro, wie die GFP-Fluoreszenz in HIOs zeigte, was adäquate Überlebens- und Differenzierungssignale aus dem Mesenchym bestätigt.Transplantierte HIO+ENS-Kokulturen exprimierten neuronale Marker, einschließlich HuCD, und Gliamarker wie S100 beta nach in vivo-Wachstum, was die Differenzierung in Neuronen und Gliazellen bestätigt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Dieses Video demonstriert die Methode zur Herstellung von motorischen Nervenorganoiden, indem zuerst humane induzierte pluripotente Stammzellen in einem speziellen Medium kultiviert werden, um Sphäroide zu bilden, dann mit spezifischen Inhibitoren in Motoneuronen differenziert und schließlich in einem mikrofluidischen Chip kultiviert werden, um Axone zu verlängern und motorische Nervenorganoide zu bilden.

Entwicklung von humanen iPSC-abgeleiteten motorischen Nervenorganoiden mit einem mikrofluidischen Chip

Dieses Protokoll ermöglicht die Differenzierung menschlicher pluripotenter Zellen in Darmorganoide. Das Protokoll ahmt die normale menschliche Entwicklung nach, indem es Zellen in eine Population von definitivem Endoderm, Hinterdarm-Endoderm und dann Darmepithel differenziert. Dadurch eignet sich das Protokoll sowohl für die Untersuchung der Darmentwicklung als auch für Anwendungen zur Modellierung von Krankheiten.

Generierung von hiPSC-abgeleiteten Darmorganoiden für Entwicklungs- und Krankheitsmodellierungsanwendungen

Hier stellen wir zwei Protokolle vor, die die Modellierung von intestinalen apikal-spezifischen Interaktionen ermöglichen. Organoid-abgeleitete intestinale Monoschichten und Air-Liquid-Interface (ALI)-Kulturen erleichtern die Erzeugung von gut differenzierten Epithelien, die sowohl von luminaler als auch von basolateraler Seite zugänglich sind, während polaritätsinvertierte Darmorganoide ihre apikale Seite freilegen und für Hochdurchsatz-Assays zugänglich sind.

Kulturmethoden zur Untersuchung apikal-spezifischer Wechselwirkungen mit intestinalen Organoidmodellen

Hier werden detaillierte Methoden zur Erzeugung, Erhaltung und Charakterisierung von humanen pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Dünndarm- und Dickdarm-Organoiden beschrieben. Diese Methoden wurden entwickelt, um die Reproduzierbarkeit zu verbessern, die Skalierbarkeit zu erweitern und die Arbeitszeit zu verringern, die für die Beschichtung und Passage von Organoiden erforderlich ist.

Erzeugung, Erhaltung und Charakterisierung von humanen pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Darm- und Dickdarm-Organoiden

Dieses Protokoll bietet detaillierte Anweisungen zur Etablierung von murinen Dünndarmorganoiden, zur Isolierung angeborener Lymphzellen des Typs 1 aus der murinen Dünndarmlamina propria und zur Etablierung von 3-dimensionalen (3D) Kokulturen zwischen beiden Zelltypen, um bidirektionale Wechselwirkungen zwischen Darmepithelzellen und angeborenen lymphatischen Typ-1-Zellen zu untersuchen.

Kokultur von murinen Dünndarm-Epithelorganoiden mit angeborenen lymphatischen Zellen

Biopsie-abgeleitete Darmorganoide und Organ-on-a-Chips-Technologien werden zu einer mikrophysiologischen Plattform kombiniert, um die regionsspezifische Darmfunktionalität zu rekapitulieren.

Kombination von menschlichen Organoiden und Organ-on-a-Chip-Technologie zur Modellierung der intestinalen regionsspezifischen Funktionalität

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um Darmorganoide von Ratten zu generieren und sie in verschiedenen Downstream-Anwendungen zu verwenden. Ratten sind oft ein bevorzugtes präklinisches Modell, und das robuste intestinale Organoidsystem erfüllt den Bedarf an einem In-vitro-System zur Begleitung von In-vivo-Studien.

Generierung und Manipulation von Ratten-Darm-Organoiden

Das Protokoll kombiniert die Technologie der menschlichen Darmorganoide mit der Transkriptomanalyse einzelner Zellen, um einen wichtigen Einblick in die bisher unerforschte Darmbiologie zu erhalten.

Verwendung menschlicher Darmorganoide zum Verständnis des Dünndarmepithels auf der Ebene der Transkription einzelner Zellen

Diese Studie skizziert ein Protokoll zur Erzeugung von 2D-Monolayern von Schweineorganoiden, die aus dem Dünn- und Dickdarm stammen. Das Wachstum dieser Monoschichten ist durch steigende TEER-Werte gekennzeichnet, was auf eine robuste epitheliale Integrität hinweist. Darüber hinaus zeigten diese Monoschichten physiologische sekretorische Reaktionen in Ussing-Kammerexperimenten nach der Anwendung von Forskolin.

Zweidimensionale Organoide des Schweine-Darms, die die physiologischen Eigenschaften des nativen Darms widerspiegeln

Die Modellierung der menschlichen Gehirnentwicklung wurde aufgrund der beispiellosen Komplexität des neuronalen Epithelgewebes behindert. In dieser Arbeit wird eine Methode zur robusten Generierung von Hirnorganoiden beschrieben, um frühe Ereignisse der menschlichen Gehirnentwicklung abzugrenzen und Mikrozephalie in vitro zu modellieren.

Die Erzeugung von iPS-derived Human Brain Organoide auf Modell Frühe Störungen der neurologischen Entwicklung

Erfahren Sie die Innervation menschlicher Darmorganoide zur Optimierung des enterischen Nervensystems. Diese Methode unterstützt die Entwicklung bioengineerter Lösungen für Kinder mit Darmversagen.

Innervation menschlicher Darmorganoide

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