Nachweis einer Helicobacter pylori-Infektion und Antibiotikaresistenz mittels Stuhl-Quantitativer Polymerase-Kettenreaktionsanalyse

Diese Studie demonstriert einen qPCR-basierten Stuhltest zum Nachweis einer Helicobacter pylori-Infektion und Antibiotikaresistenz, der eine personalisierte Behandlung ermöglicht und die Eradikationsrate von H. pylori auf Populationsebene verbessert.

Stuhlproben in Kombination mit Mengen-PCR ermöglichten einen verzögerten Nachweis von Helicobacter pylori-Infektionen und Antibiotikaresistenzen ohne Bakterienkultur, wodurch die Diagnose von drei Wochen auf einen Tag reduziert wurde.

[Erzähler] Drehen Sie zunächst das Konservierungsröhrchen um und mischen Sie es gründlich. Übertragen Sie dann einen Milliliter der Stuhlprobenlösung in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Mischen Sie die Zentrifugenröhrchen durch Inversion. Legen Sie die Röhrchen 10 Minuten lang in ein Metallbad, das auf 80 Grad Celsius eingestellt ist, und mischen Sie sie in der fünften Minute 30 Sekunden lang intermittierend. Nachdem Sie die Röhrchen auf Raumtemperatur abgekühlt haben, zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei 10.000 g. Sammeln Sie den Überstand für die weitere Verarbeitung. Nehmen Sie eine 96-Well-Platte mit Lysepuffer und drehen Sie sie mehrmals um, um die magnetischen Kügelchen wieder zu resuspendieren. Entfernen Sie vorsichtig die Dichtung der Aluminiumfolie, ohne die Platte zu schütteln, um ein Verschütten zu verhindern. Geben Sie 200 Mikroliter der vorbereiteten Probe in jede Vertiefung der 96-Well-Platte und stellen Sie sicher, dass jede Vertiefung einer einzelnen Probe entspricht. Setzen Sie die 96-Well-Platte zur automatischen Extraktion in das dafür vorgesehene Probenfach des Nukleinsäure-Extraktionsgeräts ein. Lagern Sie alle verbleibenden Proben und die extrahierten Nukleinsäureproben bei minus 20 Grad Celsius für die Langzeitkonservierung und zukünftige Verwendung. Zentrifugieren Sie das Röhrchen mit dem lyophilisierten Reagenz, um sicherzustellen, dass sich das lyophilisierte Pulver am Boden der Röhrchen absetzt. Öffnen Sie den Deckel des Reagenzröhrchens vorsichtig, um ein Verschütten des Pulvers zu vermeiden. Fügen Sie 25 Mikroliter der extrahierten Nukleinsäuren aus den zu testenden Proben hinzu. Positivkontrolle und Negativkontrolle für jede Vertiefung. Verschließen Sie die Tuben fest. Vortexen Sie die qPCR-Reagenzien acht bis 10 Sekunden lang. Zentrifugieren Sie sie dann kurz für drei bis fünf Sekunden, um Blasenbildung zu vermeiden. Setzen Sie die 96-Well-qPCR-Platte in das qPCR-Gerät ein. Stellen Sie das Fahrprogramm wie auf dem Bildschirm angezeigt ein. Stellen Sie dann die Fluoreszenzdetektionsparameter wie gezeigt ein. Nachdem Sie die Daten gespeichert haben, analysieren Sie sie mit qPCR-spezifischer Software, da das Gerät automatisch den Ausgangsschwellenwert auswählt. Legen Sie alle diagnostischen Kriterien fest, einschließlich des Vorhandenseins einer Helicobacter-pylori-Infektion oder einer Resistenz gegen einen CT-Wert von kleiner oder gleich 30. Vergewissern Sie sich, dass sie eine charakteristische S-förmige Kurve aufweisen. In dieser Abbildung sind die Ergebnisse der qPCR-Qualitätskontrolle von Negativ- und Positivkontrollen dargestellt. Die Ergebnisse bestätigten keine Amplifikation in Negativkontrollen und klare Amplifikationskurven in allen Nachweiskanälen in Positivkontrollen, was die Zuverlässigkeit des Assays bestätigt. Dieses Bild zeigt die Amplifikationskurven von fünf Stuhlproben, die mittels qPCR analysiert wurden, um eine Helicobacter pylori-Infektion und ihre Resistenz gegen Clarithromycin und Chinolone mit farbcodierten Fluoreszenzsonden nachzuweisen. Probe S1 zeigte in keinem Nachweiskanal eine signifikante Amplifikation, was das Fehlen einer Helicobacter pylori-Infektion bestätigt. Probe S2 zeigte eine Amplifikation nur im ROX-Kanal, was auf das Vorhandensein von Helicobacter pylori ohne Antibiotikaresistenz hinweist. Probe S3 zeigte eine Amplifikation in den ROX- und HEX-Kanälen, aber nicht in FAM, was auf eine Chinolonresistenz hinweist. Probe S4 zeigte eine Amplifikation in den ROX- und FAM-Kanälen, aber nicht in HEX, was auf eine Clarithromycin-Resistenz hinweist. Probe S5 zeigte eine Amplifikation in allen drei Kanälen, was auf eine duale Resistenz gegen Clarithromycin und Chinolone hinweist.