Wir danken den C-REAL-Mitgliedern für ihre Unterstützung bei der Feldbeobachtung und bei Laboranalysen.Visualisierung der mikrobiellen Dynamik des Methankreislaufs in Küstenfeuchtgebieten

Diese Studie hat die räumliche und zeitliche Verteilung der wichtigsten mikrobiellen Gene für den Methankreislauf in den Feuchtgebieten der südtexanischen Küste visuell abgeglichen und untersucht, wie Umweltfaktoren die Methandynamik regulieren. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Häufigkeit von Genen für den Methankreislauf in den Küstenfeuchtgebieten von Südtexas empfindlich auf Umweltbedingungen reagiert, einschließlich des Salzgehalts und der Jahreszeit. Insbesondere mmoX, eine Art von Methan-Monooxygenase-Gen, ist in kühleren Jahreszeiten am häufigsten.

Dieses Protokoll befasst sich mit der Forschung zum Nachweis von mikrobiellen Genen im Methankreislauf, indem es neuartige Werkzeuge zur Visualisierung der räumlichen und saisonalen mikrobiellen Dynamik bietet, die von Umweltfaktoren beeinflusst wird. Durch die Integration optimierter PCR-Methoden mit GIS-Visualisierung bietet dieses Protokoll eine verbesserte Detektion und räumliche Kartierung von Methankreislauf-Genen bei gleichzeitiger Erfassung dynamischer, räumlicher und saisonaler mikrobieller Muster, die von Umweltfaktoren beeinflusst werden.

[Erzähler] Bereiten Sie zunächst ein 25-Mikroliter-cPCR-Reaktionsgemisch mit der eDNA und anderen Komponenten vor. Legen Sie die Röhrchen in die PCR-Maschine und führen Sie die cPCR-Reaktion mit den entsprechenden Parametern durch. Bereiten Sie nach der cPCR das qPCR-Reaktionsgemisch vor, das Cybergrün enthält, ohne die Template-DNA. Geben Sie 57 Mikroliter des vorbereiteten Reaktionsgemisches in jedes PCR-Röhrchen. Geben Sie 3 Mikroliter Matrizen-DNA, Standard- oder nukleasefreies Wasser in jedes Röhrchen und klopfen Sie zum Mischen vorsichtig auf das Röhrchen. Aliquotieren Sie 20 Mikroliter des vorbereiteten Reaktionsgemisches aus jedem Röhrchen in die dafür vorgesehenen Vertiefungen einer 96-Well-qPCR-Platte. Verschließen Sie die PCR-Platte mit einer selbstklebenden PCR-Siegelfolie unter Verwendung eines Applikators. Und zentrifugieren Sie es eine Minute lang bei 1.000 x g, um eine korrekte Durchmischung zu gewährleisten und alle Blasen in den Vertiefungen zu entfernen. Setzen Sie die PCR-Platte in den Thermocycler ein. Schalten Sie das qPCR-Gerät ein und öffnen Sie die zugehörige Software, um das Protokoll einzurichten. Richten Sie das qPCR-Programm ein und initiieren Sie den Lauf. Öffnen Sie die Software für geographische Informationssysteme, ArcGIS Pro, und speichern Sie die Projektdatei mit dem Namen Study Area im angegebenen Ordner auf dem Computer. Klicken Sie auf Karte, wählen Sie Grundkarte und dann Terrain mit Beschriftungen als Basiskarte aus. Klicken Sie auf Suchen und dann auf Suchen. Wenn die Suchleiste geöffnet wird, geben Sie den Namen des Untersuchungsgebiets ein, um es auf der Karte zu finden. Um den spezifischen Bereich mithilfe der Georeferenzierung zu zeichnen, klicken Sie auf Ansicht und dann auf Katalogbereich auf der obersten Ebene. Doppelklicken Sie auf den Ordner aus dem Katalog und wählen Sie den gewünschten Dateinamen aus. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die .gdb-Datei der Geodatenbank. Klicken Sie auf Neu, und wählen Sie Feature-Class aus. Anschließend wird das Fenster Feature-Class erstellen angezeigt. Geben Sie das Feld Name und Alias ein und klicken Sie unten auf Fertig stellen. Klicken Sie nun auf Ansicht, gefolgt von Inhalt. Der Aliasname wird im Bereich Inhalt angezeigt. Klicken Sie in der obersten Ebene auf Bearbeiten, gefolgt von Erstellen. Der Bereich Features erstellen wird geöffnet. Doppelklicken Sie auf den Alias im Bereich Features erstellen, und die Optionen für Tool-Feedback konfigurieren werden angezeigt. Wählen Sie Linien aus, und skizzieren Sie dann Linien auf der Karte, um die Grenze des Untersuchungsgebiets zu erstellen. Doppelklicken Sie auf die Karte, um den Vorgang abzuschließen. Minimieren Sie die GIS-Software, und öffnen Sie eine Tabelle. Geben Sie den Namen des Beispiels in die erste Spalte, den Breitengrad in die zweite Spalte und den Längengrad in die dritte Spalte ein. Verwenden Sie die nächsten vier Spalten für qPCR-Daten von pmoA1, pmoA2, mmoX und mcrA. Speichern Sie die Datei im CSV-Format in einem bestimmten Ordner auf dem Computer. Öffnen Sie anschließend die GIS-Software, und klicken Sie auf Daten hinzufügen, gefolgt von XY-Punktdaten. Wählen Sie die gespeicherte CSV-Datei aus dem Ordner im Feld Eingabetabelle aus. Benennen Sie die Datei im Feld Ausgabe-Feature-Class um, und klicken Sie auf Ausführen, um die Probenahmepunkte auf der Karte anzuzeigen. Klicken Sie nun oben auf die Suchleiste und suchen Sie nach Kriging. Markieren Sie die Datei der Probenahmestation und wählen Sie pmoA1. Klicken Sie dann auf die Umgebung, wählen Sie die Probenahmestation in Layer und Maske aus und klicken Sie auf Ausführen. Um ein Layout der Karte zu erstellen, klicken Sie auf Einfügen, Neues Layout und wählen Sie ANSI-Querformat. Klicken Sie auf Kartenrahmen, wählen Sie die Karte mit Kriging aus und platzieren Sie alle Karten im Layout, indem Sie Rechtecke zeichnen. Wählen Sie Nordpfeil aus, und platzieren Sie ihn im Layout, um die Nordrichtung anzugeben. Wählen Sie dann Maßstabsleiste aus, um den Maßstab des Bereichs auf der Karte anzuzeigen. Klicken Sie auf Legende und platzieren Sie sie dann im Layout, um Kartenlegenden anzuzeigen. Klicken Sie auf Raster und wählen Sie dann eine beliebige Option für ein schwarzes Raster aus, um ein Raster mit Breiten- und Längengrad zu erstellen. Das Raster wird im Bereich Inhalt mit der Beschriftung Schwarzes horizontales Beschriftungsraster angezeigt. Doppelklicken Sie auf Schwarzes horizontales Beschriftungsraster, wählen Sie Komponenten aus und entfernen Sie die Teilstriche 1 und das Raster, indem Sie auf das Kreuzzeichen rechts davon klicken. Klicken Sie abschließend auf der obersten Ebene auf Freigeben und dann auf Layout exportieren. Wählen Sie den Dateityp als PDF aus, speichern Sie die Datei auf dem Computer über das Feld Name, stellen Sie die vertikale Auflösung auf 500 DPI ein, und klicken Sie auf Exportieren, um die PDF-Datei der Karte zu erstellen. Die cPCR-Analyse ergab eine räumliche Variabilität bei der Gendetektion im Zusammenhang mit dem Methankreislauf, wobei mcrA-Gene in allen LB- und RV-Proben nachgewiesen wurden, aber in BC-Proben nicht vorhanden waren, was einen Zusammenhang zwischen dem Salzgehalt und der Methanogenverteilung herstellt. Die cPCR zeigte hellere Banden für pmoA1 mit A189-mb661-Primerpaaren, was eine geringe, aber nachweisbare Häufigkeit in RV-Proben bestätigt, während sie in LB und BC nicht vorhanden war. Die qPCR-Analyse zeigte eine hohe saisonale Schwankung, wobei mmoX-Gene in der kühlen Jahreszeit am häufigsten und pmoA1 in der warmen Jahreszeit am häufigsten vorkommen.