Name: Nachweis von nukleärem Bläschen und DNA-Leckage in Säugetierzellen durch Immunfluoreszenz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-17T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 23 s
Description: Erfahren Sie den Nachweis nukleärer Bläschen und DNA-Leckage in Säugetierzellen durch Immunfluoreszenz. Diese Methode nutzt HeLa-Zellen, um Zusammenhänge zwischen Laminopathien und DNA-Reparatur zu untersuchen.

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<ol><li>Navarro, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+ZMPSTE24+%28FACE1%29+mutations+in+patients+affected+with+restrictive+dermopathy+or+related+progeroid+syndromes+and+mutation+update%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">New ZMPSTE24 (FACE1) mutations in patients affected with restrictive dermopathy or related progeroid syndromes and mutation update.</a> Eur J Hum Genet. 22 (8), 1002-1011 (2014).</li>
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<li>Goldman, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+mutant+lamin+A+causes+progressive+changes+in+nuclear+architecture+in+Hutchinson-Gilford+progeria+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Accumulation of mutant lamin A causes progressive changes in nuclear architecture in Hutchinson-Gilford progeria syndrome.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101, 8963-8968 (2004).</li>
<li>Eriksson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+de+novo+point+mutations+in+lamin+A+cause+Hutchinson%E2%80%93Gilford+progeria+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Recurrent de novo point mutations in lamin A cause Hutchinson–Gilford progeria syndrome.</a> Nature. 423, 293-298 (2003).</li>
<li>Young, S. G., Fong, L. G., Michaelis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thematic+review+series%3A+Lipid+post-translational+modifications.+Prelamin+A%2C+Zmpste24%2C+misshapen+cell+nuclei%2C+and+progeria%E2%80%94new+evidence+suggesting+that+protein+farnesylation+could+be+important+for+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Thematic review series: Lipid post-translational modifications. Prelamin A, Zmpste24, misshapen cell nuclei, and progeria—new evidence suggesting that protein farnesylation could be important for disease pathogenesis.</a> J Lipid Res. 46 (12), 2531-2558 (2005).</li>
<li>Worman, H. J., Michaelis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prelamin+A+and+ZMPSTE24+in+premature+and+physiological+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">Prelamin A and ZMPSTE24 in premature and physiological aging.</a> Nucleus. 14 (1), 1-17 (2023).</li>
<li>Pande, S., Ghosh, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+proteostasis+imbalance+in+laminopathy-associated+premature+aging+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Nuclear proteostasis imbalance in laminopathy-associated premature aging diseases.</a> FASEB J. 37 (8), 1025-1035 (2023).</li>
<li>Odell, I. D., Cook, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence techniques.</a> J Invest Dermatol. 133 (4), 1-12 (2013).</li>
<li>Kumar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+and+enzyme+immunomicroscopy+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunoassay+Immunochem%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence and enzyme immunomicroscopy methods.</a> J Immunoassay Immunochem. 21 (2-3), 235-253 (2000).</li>
<li>Tjaden, A., Giessmann, R. T., Knapp, S., Schroder, M., Muller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-content+live-cell+multiplex+screen+for+chemogenomic+compound+annotation+based+on+nuclear+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-content live-cell multiplex screen for chemogenomic compound annotation based on nuclear morphology.</a> STAR Protoc. 3 (101791), 1-15 (2022).</li>
<li>Gunn, A. L., Yashchenko, A. I., Dubrulle, J., Johnson, J., Hatch, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-content+screen+reveals+new+regulators+of+nuclear+membrane+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A high-content screen reveals new regulators of nuclear membrane stability.</a> Sci Rep. 14, 6013(2024).</li>
<li>Yu, L., Liu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosolic+DNA+sensing+by+cGAS%3A+Regulation%2C+function%2C+and+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytosolic DNA sensing by cGAS: Regulation, function, and human diseases.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (170), 1-14 (2021).</li>
<li>Odinammadu, K. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+farnesyl+transferase+inhibitor+%28FTI%29+lonafarnib+improves+nuclear+morphology+in+ZMPSTE24-deficient+fibroblasts+from+patients+with+the+progeroid+disorder+MAD-B%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">The farnesyl transferase inhibitor (FTI) lonafarnib improves nuclear morphology in ZMPSTE24-deficient fibroblasts from patients with the progeroid disorder MAD-B.</a> Nucleus. 14 (1), 1-14 (2023).</li>
</ol>

Die Kernlamina ist ein Netzwerk von Filamenten, das der Kernmembran zugrunde liegt und aus Proteinen besteht, die als Lamine bezeichnet werden. Die Kernlamina spielt eine wesentliche Rolle in der Kernarchitektur, der Positionierung der Kernporen, der Regulation der Genexpression, der Chromatinorganisation, der DNA-Replikation und der DNA-Reparatur 1,2,3. Mutationen in Genen, die eine Rolle bei der Expression der Laminproteine spielen, führen zu genetischen Störungen, die als Laminopathien bezeichnetwerden 3.
Die restriktive Dermopathie (RD) ist eine schwere laminopathische Erkrankung, die hauptsächlich durch compound-heterozygote Mutationen verursacht wird, die vorzeitige Terminationscodons im ZMPSTE24 Gen4 erzeugen, was zu einem Fehlen der Metalloprotease ZMPSTE24 führt. Diese Laminopathie ist gekennzeichnet durch intrauterine Wachstumsverzögerung, straffe, starre Haut, kleinen Mund, dünnes Haar und Knochenmineralisationsdefekte1. RD-Patienten leben aufgrund der Lungeninsuffizienz1 in der Regel nicht über die erste Lebenswoche hinaus. Zwei weitere Laminopathie-Erkrankungen, die als atypisches Hutchinson-Gilford-Progerie-Syndrom (AT-HGPS) und mandibuloakakrale Dysplasie Typ B (MAD-B) bekannt sind, beinhalten eine verminderte ZMPSTE24 Expression und sind mit einer verkürzten Lebensdauer verbunden und weisen Ähnlichkeiten mit vorzeitigen Alterungsstörungen auf5. Die ZMPSTE24 Protease, die bei diesen Laminopathien betroffen ist, ist für die posttranslationale Modifikation von Lamin A, einer kritischen Komponente der Kernlamina, von entscheidender Bedeutung. ZMPSTE24 Mangel führt zur Akkumulation einer unvollständig verarbeiteten farnesylierten Form von Lamin A, die als Prelamin A2 bekannt ist.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67719/67719fig1.jpg"> 
Abbildung 1: Lamin A-Verarbeitung in normaler vs. RD-Zellen. Lamin A-Prozessierungsweg in normalen Zellen (links) und veränderte Lamin-A-Prozessierung in RD- oder ZMPSTE-defizienten Zellen (rechts). Farnesyl (Fa) und Methyl (Me) Gruppen sind angegeben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67719/67719fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Wie in Abbildung 1 zu sehen ist, wird bei normaler Lamin-A-Verarbeitung eine Farnesylgruppe (Lipid) an einen Cysteinrest in der Nähe des C-Terminus gebunden, gefolgt von einer proteolytischen Spaltung von drei C-terminalen Aminosäuren 3,6. Der Cysteinrest wird dann methyliert. Diese beiden Modifikationen ermöglichen es, Prelamin A auf die innere Kernmembran2 zu richten. ZMPSTE24 führt dann eine Spaltungsreaktion durch, bei der die letzten 15 C-terminalen Aminosäuren zusammen mit der Farnesyl- und der Methylgruppe entfernt werden, um reifes Lamin A-Protein zu erzeugen, das an die Kernlamina 6,7,8 abgegeben wird. Bei RD, AT-HGPS und MAD-B erfolgt der letzte Schritt der Verarbeitung nicht effektiv, da die ZMPSTE24 Metalloproteinase fehlt oder nicht voll funktionsfähigist 8,9. Dies führt zur Akkumulation von Prelamin A, das dauerhaft farnesyliert und methyliertbleibt 9. Diese letzteren Gruppen führen dazu, dass das Prälamin A an der inneren Kernmembran haftet, anstatt sich an der Kernlamina zu lokalisieren, wo sich das reife Lamin A letztendlich befinden sollte, wie in Abbildung 1 zu sehen ist. Somit hat der ZMPSTE-Mangel tiefgreifende Auswirkungen auf eine Vielzahl von Kernfunktionen, zusammen mit der Kernstruktur 10,11,12,13,14,15. Diese Veränderungen der Kernstruktur können Kernblasen und sogar Kernbrüche umfassen, die zum Austreten von DNA in das Zytosol sowie zum Eindringen von Zytosol in den Zellkern führen können. Fehlerhaft geformte Zellkerne sind in der Tat ein Kennzeichen von Laminopathie-Erkrankungen, zusammen mit zahlreichen anderen Phänotypen, die durch eine fehlerhafte Prälamin-A-Verarbeitung verursacht werden16,17. Defekte in der Kernlamina führen zu einer Vielzahl von nachteiligen Auswirkungen, einschließlich der Fehllokalisierung der Qualitätskontrolle von Kernproteinen und DNA-Reparaturproteinen im Nukleoplasma, was wiederum zu zahlreichen Defekten in der Kernfunktion führt18. Es ist wichtig, eine einfache Technik zu haben, die helfen kann, diese Kennzeichen von Laminopathien zu identifizieren und zu überwachen, um die Forschung zur Entwicklung therapeutischer Ansätze zur Verbesserung der Laminopathie-Phänotypen zu erleichtern. Bei Mäusen mit Laminopathien konnte gezeigt werden, dass die Eliminierung des nukleären Blabbings mit der generalisierten Eliminierung der Laminopathie-Phänotypen korreliert16. Eine Technik, die die Überwachung der nuklearen Integrität in menschlichen Zellen ermöglicht, könnte die Erforschung potenzieller Behandlungen zur Eliminierung oder signifikanten Verbesserung von Krankheitsphänotypen verbessern.
Die indirekte Immunfluoreszenz (IF) ist eine empfindliche und weit verbreitete Technik, bei der sowohl ein primärer unmarkierter Antikörper als auch ein Fluorophor-markierter Sekundärantikörper verwendet werden, der den primären Antikörper erkennt, um ein Ziel von Interesse zu erkennen19. IF-Methoden können ein leistungsfähiges Mittel zur Visualisierung spezifischer intrazellulärer Komponenten und Strukturen darstellen. Es ist auch möglich, dass mehr als ein sekundäres Antikörpermolekül mit dem primären Antikörper interagiert, was zu einer Verstärkung des Signalsführt 19. Die indirekte IF ist eine vielseitige Technik, die auch den Nachweis mehrerer Primärantikörper mit einer relativ kleinen Anzahl von Sekundärantikörpern ermöglicht, da Sekundärantikörper gegen die Fc-Domäne des Primärantikörpers erhoben werden, die in Spezies19 konserviert ist.
Dieser Artikel beschreibt eine indirekte (IF) Methode zur Beurteilung von Kernblebbing und DNA-Leckage in Zellen mit ZMPSTE24-Mangel, wobei Antikörper gegen doppelsträngige DNA (dsDNA) und Lamin B1 zum Nachweis der DNA bzw. der Kernlamina verwendet werden. Um die Nützlichkeit dieses Ansatzes zu demonstrieren, wurde das Verfahren auf eine HeLa-Zelllinie mit Knocked-out-ZMPSTE24-Expression sowie auf eine HeLa-Zelllinie, die ZMPSTE24 exprimiert, angewendet und die Ergebnisse für die beiden Zelllinien verglichen.

<table><tbody><tr><td>22 mm quadratische Glasdeckgläser</td><td>Propper Manufacturing</td><td>Company M8710</td><td>Jede Größe und Form kann verwendet werden, solange sie an einem Standard-Objektträger befestigt werden können.</td></tr><tr><td>36,5 % Formaldehyd</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775</td><td>Fixierungsreagenz.&nbsp;</td></tr><tr><td>75 cm 2 Kolben</td><td>Corning</td><td>430725U</td><td>Für Zellkulturen.</td></tr><tr><td>Rinderserum Albinum (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>9048-46-8</td><td>Antikörper-Verdünnungspuffer.&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM mit 1 g/L Glukose, L-Glutamin & Natriumpyruvat</td><td>Corning</td><td>10-014-CV</td><td>Für die Zellkultur.&nbsp;</td></tr><tr><td>Ethanol (200 Proof)</td><td>Decon Laboratories</td><td>2701</td><td>Zur Dehydrierung von Proben vor dem Einbetten, verdünnt auf mehrere Konzentrationen.&nbsp;</td></tr><tr><td>EVOS FL Digitales inverses Fluoreszenzmikroskop</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-563-460</td><td>Bildgebung.&nbsp;</td></tr><tr><td>Fischgelatine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7041</td><td>Antikörper-Verdünnungspuffer.</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td>Eindeckmedium zur Verhinderung von Photobleichung.</td></tr><tr><td>Parafilm (4 Zoll)</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-12</td><td>Jede Größe kann ersetzt werden, solange die verwendeten Deckgläser passen.&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15-140-122</td><td>Für die Zellkultur.</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Hergestellt und sterilisiert im Labor für Gewebekulturen und Lösungen.</td></tr><tr><td>Premium Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>Für die Zellkultur.&nbsp;</td></tr><tr><td>Superfrost Premium Objektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-7</td><td>Es können alle gängigen Objektträger verwendet werden.&nbsp;</td></tr><tr><td>Mit Gewebekulturen behandelte 6-Well-Platten mit flachem Boden</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td>Für die Zellkultur.</td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A16046. AP</td><td>Zum Waschen.</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,5%)</td><td>Gibco</td><td>15-400-054</td><td>Für Zellkulturen.&nbsp;</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>9005-64-5</td><td>Reagenz für Zellpermeation.&nbsp;</td></tr></tbody></table>

nachweis von nukleärem bläschen und dna-leckage in säugetierzellen durch immunfluoreszenz

Detection of Nuclear Blebbing and DNA Leakage in Mammalian Cells by Immunofluorescence

In dieser Arbeit wird eine IF-Methode zur Visualisierung der Kernlamina in Verbindung mit doppelsträngiger DNA (dsDNA) vorgestellt. Sobald die IF durchgeführt wurde, können die aufgenommenen Bilder auf Anzeichen von nukleärem Blubbing und DNA-Leckagen untersucht werden.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67719/67719fig2.jpg"> 
Abbildung 2: Kernblebbing in HeLa CT u...

Nachweis von nukleärem Bläschen und DNA-Leckage in Säugetierzellen durch Immunfluoreszenz

The nuclear lamina is a network of filaments underlying the nuclear membrane, composed of lamins and lamin-associated proteins. It plays critical roles in ...

detection-nuclear-blebbing-dna-leakage-mammalian-cells

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Verfahren zur Beobachtung der einzelnen DNA-Molekülen in lebende Zellen beschrieben. Die Technik basiert auf der Bindung eines fluoreszenzmarkierten Proteins an lac-Repressor-Bindungsstellen in die DNA von Interesse entwickelt basiert. Dieses Verfahren kann gut auf rekombinanten DNAs in lebende Zellen im Laufe der Zeit zu folgen.

Überwachung Plasmid-Replikation in lebenden Säugerzellen über mehrere Generationen durch Fluoreszenz-Mikroskopie

In diesem Video beschreiben wir die Immunfluoreszenzmethode, um die Lokalisation der DNA-Reparaturproteine γH2AX und 53BP1 an den Stellen von Doppelstrang-DNA-Brüchen in bestrahlten Zellkernen sichtbar zu machen.

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In diesem Video beschreiben wir die Immunfluoreszenzmikroskopie-Technik zum Nachweis spezifischer DNA-Schadensreaktionsproteine, die an den Stellen von DNA-Doppelstrangbrüchen in menschlichen mononukleären Zellen lokalisiert sind. Die Proteine werden von spezifischen Primärantikörpern erkannt, die wiederum an Fluorophor-markierte Sekundärantikörper binden, die während der mikroskopischen Visualisierung fluoreszieren, was die Visualisierung der Proteine als unterschiedliche Fluoreszenzherde...

Immunfluoreszenzmikroskopie zur Analyse von DNA-Doppelstrangbrüchen

Dieses Manuskript beschreibt eine neuartige Technik, die den Nachweis der intrazellulären Genexpression nach Endozytose von fluoreszenzmarkierten Nanopartikeln direkt in lebenden Zellen ermöglicht. Die Methode erfordert keine Manipulation der Zellen und ist in Bezug auf das Zielgen oder die Zielspezies nicht eingeschränkt.

Der Nachweis von intrazellulären Genexpression in lebenden Zellen der Maus, Mensch und Schwein Origin Mit Fluoreszenz-markierter Nanopartikel

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Laser Microirradiation ist ein nützliches Werkzeug für Studien zur DNA-Reparatur in lebenden Zellen. Ein methodischer Ansatz für die Nutzung der UVA Laser induzieren verschiedene DNA-Läsionen wird angezeigt. Wir haben eine Methode zur lokalen Microirradiation optimiert, die den normalen Zellzyklus unterhält; so fahren Sie bestrahlte Zellen durch Mitose.

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Live Cell Imaging bietet eine Fülle von Informationen über einzelne Zellen oder ganze Bevölkerungen, die unerreichbar ist von festen Cell imaging allein. Hier werden live-Cell imaging Protokolle Zelle Schicksal Entscheidungen nach der Behandlung mit Anti-mitotische Droge Paclitaxel bewerten beschrieben.

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Nachweis von nukleärem Bläschen und DNA-Leckage in Säugetierzellen durch Immunfluoreszenz

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