Genome Editing bei der Gelbfiebermücke Aedes aegypti mittels CRISPR-Cas9

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Genom-Editierung durch embryonale Mikroinjektion in der Mücke A. aegypti unter Verwendung der CRISPR-Cas9-Technologie.

Im Rahmen unserer Forschung etablieren wir gentechnisch veränderte Mückenlinien mit Hilfe der CRISPR-Cas9-Technologie. Der Einsatz der CRISPR-Cas9-Technologie zur Unterdrückung von Mückenpopulationen, PgSIT, sowie zur Etablierung von binären Expressionssystemen zur räumlich-zeitlichen Kontrolle der Genexpression.

Wir haben sowohl Knockout- als auch Knockin-Linien mit der CRISPR-Cas9-Technologie erhalten. Zu unseren Knockin-Linien gehört die Insertion des QF-Transaktivators, der eine räumliche zeitliche Kontrolle von nachgeschalteten Genen ermöglicht, wie z. B. Fluoreszenzmarker, GFP, für die gewebespezifische Markierung und Reporter der neuronalen Aktivität, G-CaMP6.

Die Etablierung neuartiger Mückenmutantenlinien wird ein tieferes Verständnis der Genfunktion und der Auswirkungen auf Nerven, Physiologie und Verhalten ermöglichen. Dies kann zur Entwicklung neuartiger Wege führen, um die Übertragung von durch Stechmücken übertragenen Krankheiten zu verhindern. Unser Labor hat die Technologie zur Unterdrückung von Mückenpopulationen entwickelt, die auf der CRISPR-Cas9-Technologie beruht, um Gene auszuschalten, die mit der männlichen Fruchtbarkeit und der weiblichen Lebensfähigkeit zusammenhängen. Außerdem haben wir mehrere Mückenlinien für die Untersuchung der sensorischen Resistenz von Mücken, insbesondere des Geruchssinns und des Sehvermögens, etabliert.

[Interviewer] Um das Injektionskonstrukt für Knockout-Mutanten vorzubereiten, verdünnen Sie das Cas9-Protein mit dem Cas9-Verdünnungspuffer auf die gewünschte Konzentration. Verdünnen Sie dann das Aliquot der in vitro synthetisierten Guide-RNA oder gRNA mit Reinstwasser. Mischen Sie das verdünnte Cas9-Protein mit jeder gRNA vor, um einen Ribonukleoproteinkomplex zu bilden. Kombinieren Sie dann die mehrfach vorgemischten Ribonukleoprotein-Komplexlösungen. Für homologiegesteuerte reparaturvermittelte Genkassetteninsertionen verdünnen und mischen Sie das Cas9-Protein und die gRNAs. Verdünnen Sie das Donorplasmid mit Reinstwasser und kombinieren Sie alle Konstrukte. Verwenden Sie anschließend ein Quarzfilament, um die Mikroinjektionsnadeln vorzubereiten. Mit dem folgenden Programm. Ziehen Sie die Nadeln mit einem Laser-Mikropipettenabzieher. Nachdem Sie einen manuellen Absauger aufgestellt haben, befeuchten Sie weißes Kreisfilterpapier und legen Sie es entweder auf die Innenwand oder auf die feuchte Watte im Inneren des Auffangbehälters. Legen Sie fünf bis 10 weibliche Mücken, die vor fünf bis 10 Tagen mit Blut gefüttert wurden, in den Sammler. Stellen Sie den Sammler dann für 45 Minuten in die Dunkelheit. Entfernen Sie anschließend die Mücken aus dem Auffangbehälter. Entfernen Sie nach der Inkubation die Filterpapiere, um die Embryonen zu entnehmen. Wählen Sie Embryonen aus dem Prä-Blastoderm-Stadium, die hellgrau aus dem Entnahmepapier sind. Übertragen Sie ausgewählte Embryonen mit einer feuchten Bürste auf doppelseitiges Klebeband, das auf einem Deckglas angebracht ist. Richten Sie die Embryonen parallel aus und stellen Sie sicher, dass sie nebeneinander liegen, wobei alle hinteren Enden nach vorne zeigen, während ihre Umgebung feucht bleibt. Geben Sie während der Ausrichtung Halocarbon Oil 700 auf die Embryonen, um ein Austrocknen zu verhindern. Stellen Sie auf dem Mikroinjektor einen Ausgleichsdruck von 300 Hektopascal und einen Injektionsdruck von 500 Hektopascal ein. Laden Sie mit einem Mikrolader drei Mikroliter des Injektionskonstrukts in eine Nadel. Legen Sie das Deckglas mit den ausgerichteten Embryonen auf einen Objektträger und positionieren Sie es für die Injektion unter dem Mikroskop. Befestigen Sie anschließend eine Nadel mit einem Mikromanipulator in einem Winkel von 10 Grad in Richtung des hinteren Endes der Embryonen. Öffnen Sie die Nadel vorsichtig, indem Sie die Spitze leicht mit der Spitze an den Rand des Deckglases berühren. Injizieren Sie dann dem Embryo das Plasmidkonstrukt. Nach der Injektion von Aedes agyptie-Mücken mit Injektionskonstrukt verwenden Sie fusselfreie Einwegtücher, um das Öl zu entfernen, das die Embryonen umgibt. Fügen Sie deionisiertes Wasser hinzu, um die Embryonen zu spülen. Übertragen Sie die gespülten Embryonen auf ein feuchtes Filterpapier und legen Sie das Filterpapier auf ein feuchtes Tuch in einem Karat-Becher mit neun Unzen. Lege dann nasse Watte auf den Boden des Bechers, um die Feuchtigkeit zu halten. Nachdem Sie die Embryonen drei bis vier Tage lang feucht gehalten haben, geben Sie das Filterpapier mit den Embryonen zum Schlüpfen in eine Sterilite-Sechs-Liter-Pfanne in etwa drei Liter deionisiertes Wasser. Sobald die G zero Larven geschlüpft sind, mit Wasser vermischtes Fischfutter in die Pfanne geben. Screening der G null-Larven auf den Fluoreszenzmarker im dritten bis vierten Larvenstadium des Stadiums. Trennen Sie die Larven nach ihrem Fluoreszenzstatus. Halten Sie fluoreszierend-positive und fluoreszierend-negative Larven in getrennten Pfannen. Trennen Sie die injizierten Mücken nach Geschlecht, wenn sie sich verpuppen, und identifizieren Sie die Männchen an ihrer geringeren Größe, dem markanteren und spitzeren Genitallappen und den breiteren Paddeln. Identifiziere Weibchen an ihrer größeren Größe, dem weniger ausgeprägten Genitallappen und den schmaleren Paddeln. Nach dem Pooling von fluoreszierenden positiven oder fluoreszierenden negativen Mücken jedes Geschlechts wird jeder Pool mit Mücken des anderen Geschlechts aus dem Wildtyp-Stamm Liverpool A. agyptie in einem Verhältnis von drei bis fünf Wildtyp-Individuen für jedes fluoreszierend gescreente Individuum gekreuzt, so dass sie sich vier Tage lang paaren können. Nach drei bis vier Tagen wird die G1-Larve im dritten bis vierten Larvenstadium des Stadiums auf den fluoreszierenden Marker untersucht.