Aufreinigung des Sarko-endoplasmatischen Retikulums Ca²⁺-ATPase aus dem Kaninchenmuskel

Unsere Forschung konzentriert sich auf die Reinigung von SERCA mit hoher struktureller Qualität und katalytischer Aktivität, während untersucht wird, ob Trehalose SERCA während der Reinigung stabilisiert und seine Stabilität und Funktionalität verbessert. Die Bestimmung der dreidimensionalen Struktur von P-Typ ATPasen in ihren oligomeren Zuständen. Der Einsatz künstlicher Intelligenz für die strukturelle Modellierung von ATPasen, Strukturdynamiksimulationen und molekulares Andocken von Liganden zur Erforschung von Krankheitstherapeutika und zur Verbesserung der Proteinfunktionsanalyse und neuerer Technologien. Zu den aktuellen Herausforderungen gehören das Verständnis der Energieumwandlungsmechanismen in P-ATPasen, die Aufklärung, wie die Quartärstruktur Funktion und Aktivität reguliert, und die Identifizierung wirksamer Inhibitoren für die therapeutische Anwendung bei menschlichen Krankheiten. Wir bestätigen den hexameren Zustand der GS-Plasmamembran Proton-ATPase und zeigen ihre strukturdynamische Abhängigkeit bzw. mittlere Viskosität, wie sie in der Kramersschen Theorie beschrieben wird.

[Erzähler] Zu Beginn erhältst du schnell zuckende Muskeln vom Wildtyp Oryctolagus cuniculus. Suspendieren Sie es in drei Volumina mit 100 Millimolar Kaliumchlorid zur Mazeration. Eine Minute lang mixen, gefolgt von einer Minute eiskalter Ruhe. Zentrifugieren Sie die Probe bei 1.500 g bei 4 Grad Celsius für 5 Minuten, um die Gewebereste zu entfernen. Sammeln Sie den Überstand in einem Röhrchen und homogenisieren Sie ihn dann mit einer Gewebemühle. Als nächstes zentrifugieren Sie das Homogenat, gefolgt von dem Überstand. Suspendieren Sie die Pellets in etwa 40 Millilitern 0,5 molaren Saccharose. Zentrifugieren Sie nun die Suspension bei 12.000 g bei 4 Grad Celsius für 15 Minuten. Der resultierende Überstand wird vor dem Zentrifugieren in 0,6 molaren Kaliumchlorid und 0,15 molaren Saccharose verdünnt. Das Pellet mit den sarkoplasmatischen Retikulum-Vesikelblättern wird in einem Puffer suspendiert, der 0,3 molare Saccharose, 0,1 molare Kaliumchlorid und 5 millimolare Tris-Hydrochlorid bei einem pH-Wert von 7,0 enthält. Aliquotieren Sie die sarkoplasmatischen Retikulumvesikel in 1 Milliliter Volumen. Die Suspension der sarkoplasmatischen Retikulum-Vesikel wird 10 Minuten lang unter leichtem Rühren auf Eis inkubiert, dann zentrifugiert. Suspendieren Sie das Pellet in weniger als 3 Millilitern 25 Millimolar Tris-Hydrochlorid-Puffer. Nach dem Homogenisieren der Suspension wird sie mit Tris-Hydrochlorid-Puffer auf ein Endvolumen von 10 Millilitern eingestellt. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit dem Lowry-Assay. Fügen Sie Azolectin in einer Menge von 5 Milligramm pro Milliliter hinzu und fügen Sie dann 0,85 Zwittergent 3-14 hinzu. Die Suspension erneut homogenisieren und bei 100.000 g bei 4 Grad Celsius 60 Minuten lang zentrifugieren. Sammle den Überstand in einem neuen Röhrchen. Verdünnen Sie es im Verhältnis 1 zu 2 mit 2 Millimolar EGTA bei pH 7,2. Gießen Sie die Suspension vorsichtig auf einen diskontinuierlichen Trehalose-Konzentrationsgradienten in Tris-Puffer. Dann wie bisher zentrifugieren und das durchsichtige, leicht gelbe Pellet auffangen. Suspendieren Sie das Pellet vorsichtig in einer kleinen Menge Tris-Puffer. Messen Sie die Proteinkonzentration und verdünnen Sie sie dann, um die Proteinkonzentration auf 2 Milligramm pro Milliliter einzustellen. Für die ATPase-Aktivität wird 1 Milliliter des Reaktionsgemisches vorbereitet. Den Reaktionsassay zur Homogenisierung vortexen, dann 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Fügen Sie 0,9 Einheiten L-Lactat-Dehydrogenase und 1,5 Einheiten Pyruvatkinase hinzu. Fügen Sie 10 Mikrogramm SERCA hinzu, um die ATPase-Reaktion zu starten. Überwachen Sie die Absorptionsänderung jede Sekunde für 600 Sekunden bei 340 Nanometern mit einem Spektralphotometer, das über einen thermostatischen Küvettenhalter verfügt, um die Bildung von NAD zu bestimmen. Für den Markierungsassay von SERCA mit Fluoresceinisothiocyanat oder FITC werden zunächst 20 Mikrogramm SERCA in 50 Mikrolitern Markierungspuffer suspendiert. Vortex, um gut zu mischen. Inkubieren Sie die Proben dann im Dunkeln bei Raumtemperatur für 15, 10, 7, 5 und 2 Minuten. Um die Markierungsreaktion zu stoppen, fügen Sie ein gleiches Volumen eiskalten Stopppuffer hinzu. 5 Minuten im Dunkeln auf Eis inkubieren. Unterwerfen Sie die mit dem FITC-Label gekennzeichnete SERCA SDS-PAGE. Setzen Sie die klaren Gele ultraviolettem Licht bei einer Wellenlänge von 302 Nanometern aus und dokumentieren Sie das Ergebnis. Zum Schluss färben Sie das Gel mit Coomassie blue. Dokumentieren Sie das Ergebnis. Für die Analyse der Zirkulardichroismus-Spektren suspendieren Sie SERCA zunächst in 400 Mikrolitern 10 millimolaren Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,0 bei 25 Grad Celsius. Laden Sie die Probe in eine Zelle mit einer Weglänge von 0,1 Zentimetern. Stellen Sie nun den Bereich der Spektren im fernen Ultraviolett zwischen 190 und 260 Nanometern und die interne Auflösung und Bandbreite auf 1 Nanometer ein. Nehmen Sie das Signal des Zirkulardichroismus mit einer Geschwindigkeit von 50 Nanometern pro Minute bei 25 Grad Celsius auf. Das blau gefärbte SDS-PAGE-Gel von Coomassie zeigte die Anreicherung der SERCA-Proteinbande im Laufe der Reinigung. Der abschließende SERCA-Reinigungsschritt mittels Ultrazentrifugation auf einem Trehalose-Konzentrationsgradienten führte zu einer Reinheit von über 90 %. Sarkoplasmatische Retikulumvesikel enthielten eine hohe Menge an SERCA, wobei etwa 73% des Gesamtproteins in den Vesikeln dieser P-ATPase entsprachen. Für das gereinigte SERCA wurde ein kinetisches Muster in der ATP-Hydrolyserate im Vergleich zur ATP-Konzentrationskurve beobachtet, was seine enzymatische Funktionalität bestätigt. Das Lineweaver-Burk-Diagramm ergab eine Michaelis-Konstante von etwa 10 Mikromol für ATP, was mit den zuvor berichteten Werten übereinstimmt. Die FITC-Markierung von SERCA deutete auf eine intakte Nukleotidbindungsstelle hin. Das in Coomassie blau gebeizte SERCA-Band entsprach exakt dem mit FITC beschrifteten Band. Die Zirkulardichroismusspektroskopie bestätigte die hohe strukturelle Qualität des gereinigten SERCA, wobei sein Spektrum auf gut definierte Sekundärstrukturelemente hinweist.