Extraktion und Gewebereinigung Aufbereitung von Proben aus dem Gehirn und dem Rückenmark der Maus

Unsere Forschung konzentriert sich darauf, wie das zentrale Nervensystem die kognitiven Funktionen vermittelt und mit dem Immunsystem interagiert. Unser Ziel ist es, die Methoden zur Untersuchung des Gehirns und des Rückenmarks zu verbessern und die grundlegenden Fragen zu diesen Wechselwirkungen zu beantworten. Auf diese Weise bleiben das gesamte Gehirn und das Rückenmark intakt, was uns hilft, die Zelle durch Gewebereinigung besser zu kartieren. Außerdem wird der Prozess schneller und genauer, wodurch der Zeitaufwand und die Fehler im Vergleich zu herkömmlichen Schnitt- und Bildgebungsverfahren reduziert werden.

Wir haben das Gehirn und die Rückenmarksregionen, die mit der Lunge verbunden sind, kartiert. Unsere Forschung wird sich auf die Erforschung der neuroimmunen Kommunikation zwischen Gehirn, Rückenmark und Lunge konzentrieren. Und wie diese Wechselwirkung die Immunantwort beeinflusst.

[Dozent] Befestigen Sie zunächst die Gliedmaßen der Maus mit Stahlklammern an der breiten Acrylplatte. Schneiden Sie mit einer Schere die Haut zwischen den beiden Oberschenkelknochen ein und schneiden Sie weiter nach oben, bis Sie das Zwerchfell erreichen. Öffnen Sie beide Seiten des Brustkorbs durch das Zwerchfell und legen Sie das Herz mit einer Schere und einer geraden Pinzette frei. Führen Sie eine 0,7 Millimeter lange Infusionsnadel, die an einem Perfusionsschlauch befestigt ist, in den linken Ventrikel ein und machen Sie einen ein bis zwei Millimeter großen Schnitt im rechten Vorhofohr. Trennen Sie nach der Perfusion die Haut am Rücken und Kopf der Maus mit einer Augenschere. Durchtrennen Sie die Wirbelsäule an der Stelle, an der die Linie, die die oberen Hinterkanten beider Gliedmaßen verbindet, mit der Wirbelsäule schneidet. Entfernen Sie Muskel- und Fettgewebe vom Hals und Rücken der Maus, um die Wirbelsäule und den Schädel freizulegen. Schneiden Sie mit einer Venenschere entlang des Mittellinienspalts zwischen der linken und rechten Seite der Wirbelsäule und des Rückenmarks vom unteren Ende des Wirbelkanals aus. Entfernen Sie dann den oberen Teil und die beidseitigen Seiten der durchtrennten Wirbelsäule, um das Rückenmark freizulegen. Wiederholen Sie die Schritte, bis Sie die Gehirnverbindung erreicht haben. Platzieren Sie die Spitze einer Klinge der Venenschere zwischen dem Foramen magnum und dem Gehirn. Schieben und schneiden Sie entlang der mittleren sagittalen Naht, um den Schädel zu öffnen. Benutze eine Pinzette, um den Schädel zu entfernen und das Gehirn freizulegen. Entfernen Sie nun mit einer Pinzette und einer Venenschere das Rückenmarksgewebe des Mausgehirns vom Schädelende. Verwenden Sie eine Präparierzange, um die Rückenmarksmembran unter dem Stereomikroskop zu entfernen. Befestigen Sie anschließend die Rückenmarksprobe des Gehirns mit Nähten auf der Fixierplatte. Mindestens das 20-fache des Probenvolumens von 4 % Paraformaldehyd zugeben. Nach der Fixierung das Paraformaldehyd verwerfen und die Probe dreimal mit PBS waschen. Fixieren Sie zunächst das extrahierte Rückenmark des Mausgehirns in Paraformaldehyd. Für die Lipidentfernungslösung werden Lösung A und B in einem Massenverhältnis von neun zu eins gemischt. Geben Sie 50 Milliliter der Lipidentfernungslösung in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und legen Sie das fixierte Gewebe hinein. Nach der Inkubation in Lösung C wird die Lösung gewechselt und die Kulturschale mit der vollständig in Lösung C eingetauchten Probe auf einen Leuchtkasten mit einer Skalenlinie gestellt. Zur Herstellung der Gellösung geben Sie 147 Gramm Lösung C und drei Gramm Agarose in eine 200-Milliliter-Glasflasche. Die Komponenten mit einem Rührstab gut vermischen, dann in der Mikrowelle erhitzen, bis sich die Agarose aufgelöst hat. Übertragen Sie die Gellösung in einen Laborofen, der auf 37 Grad Celsius eingestellt ist. Gießen Sie eine zwei Millimeter tiefe Schicht aus 37 Grad Celsius temperierter Gellösung in die Form und kühlen Sie sie in einem vier Grad Celsius heißen Kühlschrank 30 Minuten lang ab, bis sie halbfest ist. Legen Sie die auf den Brechungsindex abgestimmte Probe in die Form und fügen Sie die Gellösung bis zur Höhe oder etwas unterhalb der Oberseite der Probe hinzu. Stelle die Form für zwei Stunden wieder in den vier Grad Celsius heißen Kühlschrank. Mit einem Deckglas abdecken und wieder in den Kühlschrank stellen. Entfernen Sie das Deckglas mit einer Pinzette und nehmen Sie die eingebettete Probe heraus. Geben Sie 30 Milliliter Bildgebungslösung in ein 50-Milliliter-Röhrchen und tauchen Sie die Probe in die Lösung. Tragen Sie den Klebstoff 502 auf, um die Probe fest auf dem Probenhalter zu befestigen, bevor Sie den Halter auf dem Bildgebungsgerät befestigen. Führen Sie die Scansoftware aus und wählen Sie die 4-fache Vergrößerungsstufe im Vergrößerungsbereich aus. Klicken Sie auf die Schaltfläche Kalibrierung, um den Kalibrierungsmodus zu aktivieren. Klicken Sie auf die Vorschauschaltfläche, um den Vorschaumodus aufzurufen. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche für die Bewegung in Z-Richtung, um die Probe langsam vom Boden der Probenkammer nach oben zu bewegen, bis das erzeugte Lichtblatt die Probe passiert. Wählen Sie die entsprechende Option für den Laserkanal und den Beleuchtungsmodus aus. Wählen Sie die Scanpfadrichtung für die Probe aus. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Automatischer Scan", um die Aufnahme der Bilder der Probe zu starten. Das Protokoll konservierte erfolgreich das gesamte Gehirn und das Rückenmark der Maus, während die Fluoreszenzsignale für eine klare Bildgebung intakt blieben. Die Fluoreszenzbildgebung der Rückenmarksprobe des Gehirns machte detaillierte neuronale Strukturen deutlich sichtbar. Bilder mit höherer Vergrößerung ermöglichten eine verbesserte Visualisierung einzelner fluoreszenzmarkierter Zellen.