Name: Duale CRISPR-Interferenzstrategie zur gezielten gezielten Behandlung synthetischer letaler Wechselwirkungen zwischen nicht-kodierenden RNAs in Krebszellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Erfahren Sie die duale CRISPRi-Strategie zur kombinatorischen Gen-Knockdown in Melanomzellen. Diese Methode identifiziert synthetisch letale lncRNA-Wechselwirkungen für neue Krebstherapien.

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Obwohl weniger als 3 % des menschlichen Genoms Proteine kodieren, werden etwa 80 % des Genoms transkribiert 1,2. Unter den nicht-kodierenden Transkriptionseinheiten werden Zehntausende als lange nicht-kodierende RNAs (lncRNAs) mit mehr als 200 Nukleotiden klassifiziert, und die Gesamtzahl der humanen lncRNAs wird auf über 100.000 geschätzt 3,4. Im Gegensatz zu kodierenden Genen sind lncRNAs bei allen Arten weniger konserviert. Angesichts der Tatsache, dass der Mensch 99% seines Genoms mit Primaten wie Schimpansen teilt, wird angenommen, dass lncRNAs einen viel größeren Einfluss auf die phänotypische Evolution haben 5,6. Diese Ergebnisse deuten auf wichtige zelluläre Funktionen von lncRNAs hin. Obwohl die Regulation von lncRNAs und ihre Wechselwirkungen mit RNA-bindenden Proteinen und anderen RNAs noch unvollständig verstanden sind und viele lncRNAs noch nicht vollständig annotiert sind, ist es klar, dass lncRNAs zell- und gewebespezifische Expressionsmuster bei Gesundheit und Krankheit aufweisen, wie z. B. Krebs 7,8,9,10. Sie sind an verschiedenen Funktionen beteiligt, darunter die Regulation der Gentranskription, die Beteiligung an Chromatininteraktionen11, die RNA-Verarbeitung12, die RNA-Stabilisierung13 und die Regulation der Translation14.
Bei Krebs beeinflussen sehr unterschiedliche zelltypspezifische lncRNAs die Tumorentwicklung und Metastasierung, indem sie die Genexpression regulieren, was ihr Potenzial als wertvolle therapeutische Ziele unterstreicht15. Neben dem Nachweis von lncRNAs als Biomarker in Tumorproben16 birgt die gezielte Störung ihrer nachgeschalteten Funktionen durch tumorspezifische lncRNAs sowohl in klinischen Anwendungen als auch in der Grundlagenforschung erhebliches Potenzial. RNA-basierte Ansätze zur Aufklärung der Rolle von lncRNAs umfassen Antisense-Oligonukleotide (ASOs), kurze Hairpin-RNAs und kleine interferierende RNAs (siRNAs)17,18. Während siRNA häufig für Gen-Silencing-Screens verwendet wird, ist der siRNA-basierte Knockdown auf das Zytoplasmabeschränkt 19. lncRNA arbeitet jedoch häufig im Zellkern.
Alternativ kann die Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats Interference (CRISPRi) verwendet werden, um lncRNAs bei menschlichen Krebserkrankungenzu hemmen 20. Darüber hinaus können genomweite CRISPRi-Screens einfach programmiert werden und zielen auf ein breites Spektrum kodierender und nicht-kodierender Gene ab, um ihre funktionellen Auswirkungen zu untersuchen21,22. In CRISPRi wird ein katalytisch defizientes Cas9 (dCas9) mit einer transkriptionellen Repressordomäne, wie z.B. der Krüppel-associated box (KRAB) Domäne23, fusioniert. Die Genrepression durch dCas9-KRAB wird durch eine Leit-RNA (gRNA) in die interessierende Region geleitet. CRISPRi kontrolliert Gene auf DNA-Ebene, was zu einer höheren Effizienz und den gewünschten Loss-off-Funktionsphänotypen führt, im Gegensatz zur RNA-Interferenz, die auf der posttranskriptionellen Ebene aktiv ist24. Als Reaktion auf die begrenzte Wirksamkeit von KRAB beim Target-Silencing wurde eine Fusion von KRAB und MeCP2 mit dCas9 als effektivere Unterdrückungsstrategie eingeführt25.
Obwohl das Silencing einzelner Gene die Lebensfähigkeit von Krebs beeinträchtigen kann, können synthetische duale oder multiple letale Wechselwirkungen Krebszellen vor dem Zelltod retten26. Bei der synthetischen Letalität sind zwei oder mehr Gene beteiligt, von denen jedes die Funktion des anderen kompensieren kann. Um Probleme mit Einzelgen-Knockdown-Screenings zu überwinden, bieten duale CRISPR-Strategien, die auf letale proteinkodierende Genpaare abzielen, einen vielversprechenden Ansatz27.
In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll für die kombinatorische Verwendung von orthogonalem CRISPRi-basiertem Targeting von lncRNA oder anderen nicht-kodierenden RNA-Paaren unter Verwendung von Staphylococcus aureus und Streptococcus pyogenes dCas9 vor, die mit KRAB-MeCP2 in humanen Melanomzellen fusioniert sind (siehe Abbildung 1). Das Protokoll kann für den kombinatorischen klassischen CRISPR-Knockdown oder als CRISPRi-basiertes Screening von synthetischen Letalpaaren bei Krebs verwendet werden. Die Verwendung von zwei verschiedenen dCas9-Spezies, SpCas9 und SaCas9, im CRISPRi-Ansatz ermöglicht ein unabhängiges Targeting unterschiedlicher genomischer Loci mit minimaler Kreuzreaktivität, was die Spezifität und Flexibilität verbessert und gleichzeitig eine hohe On-Target-Selektivität gewährleistet. Es werden verschiedene Protospacer-benachbarte Motive (PAMs) verwendet: NGG für SpCas9 und NNGRRT für SaCas9. Das duale dCas9-System adressiert Herausforderungen wie die eingeschränkte sgRNA-Kompatibilität, indem es eine präzise, gleichzeitige Modulation ermöglicht und die Konkurrenz zwischen sgRNA-RNP-Komplexen reduziert, wenn ein einzelner Typ von dCas9 verwendet wird. Diese Innovation verbessert die Robustheit und Vielseitigkeit des Dual-sgRNA-Bibliotheksscreenings. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass wir ein voll funktionsfähiges duales CRISPRi-System in Melanomzellen als Krebsmodell zur Verfügung stellen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67752/67752fig01.jpg"> 
Abbildung 1: Schema des dualen CRISPRi-Systems zur gezielten Behandlung synthetischer letaler Wechselwirkungen von nicht-kodierenden RNAs. (A) Klonierungsverfahren des dualen gRNA-Vektors. (B) HEK293-Zellen wurden mit dem Hüllplasmid VSV-G, dem Verpackungsplasmid PAX2 und dem Transfervektor transfiziert, um Lentiviren für die anschließende Transduktion in 501-mel-Zellen zu produzieren. Lentiviren, die die genetische Information für SpdCas9-KRAB-MeCP2 (blau) und SadCas9-KRAB-MeCP2 (rot) enthalten, wurden gleichzeitig in 501-mel-Zellen eingebaut. Nach der Antibiotikaauswahl wurde eine zweite lentivirale Transduktion durchgeführt, um die gewünschten dualen gRNAs (olivgrün) zu integrieren. (C) 501-mel-Zellen, die die dCas9-Varianten exprimieren, interagieren mit ihren entsprechenden gRNAs, um die Expression des Zielgens zum Schweigen zu bringen, was zum Tod von Krebszellen führt. Erstellt mit BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/67752fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

<table><tbody><tr><td>Amicon Ultra Zentrifugalfilter, 100 kDa MWCO</td><td>Millipore</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>anti-Cas9 (S. aureus) (6H4) monoklonaler Maus-Antikörper</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>48989</td><td></td></tr><tr><td>anti-Cas9 (S. pyogenes) (7A9-3A3) monoklonaler Antikörper</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>14697</td><td></td></tr><tr><td>anti-GAPDH monoklonaler Maus-Antikörper</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8795</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus-IgG (ganzes Molekül)&ndash; Peroxidase-Antikörper, hergestellt im Kaninchen</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9044</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin S Hydrochlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>15205-25MG</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo Lumineszierender Zellviabilitätsassay</td><td>Promega</td><td>G7570</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>CFX Connect Real-Time PCR Nachweissystem</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clarity Western ECL-Substrat, 500 mL</td><td>Bio-Rad</td><td>1705061</td><td></td></tr><tr><td>CO2-Inkubator Modell CB 170</td><td>Binder</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Proteaseinhibitor Cocktail</td><td>Roche</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>Esp3I (BsmB1) Restriktionsenzym</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER0451</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 10 mL Serologische Pipette</td><td>Corning</td><td>356551</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 25 mL Serologische Pipette</td><td>Corning</td><td>357525</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5 mL Serologische Pipette</td><td>Corning</td><td>356543</td><td></td></tr><tr><td>fötales Rinderserum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F9665-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Dulbecco' s modifizierter Eagle" Die</td><td>Gibco-41966029</td><td></td><td></td></tr><tr><td>humane Melanom-Zelllinie 501-mel</td><td>wurde freundlicherweise vom Aifantis Lab (New York University) zur Verfügung gestellt:</td> <td>CVCL_4633</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon -P PVDF Membran</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Lenti-X 293T HEK-Zelllinie</td><td>Takara Bio</td><td>632180</td><td></td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot Zellsystem&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Handcast System</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi-DNA-Assemblierungsreaktion&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>E2621</td><td></td></tr><tr><td>Fettfreies Milchpulver&nbsp;</td><td>Biomol</td><td>54650</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Probenpuffer (4x)</td><td>Invitrogen</td><td>NP0008</td><td></td></tr><tr><td>One Shot Stbl Chemisch kompetent E. coli</td><td>Invitrogen</td><td>C737303</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduziertes Serummedium</td><td>Gibco</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>PCR-Röhrchen 0,5 ml (Flat Cap)</td><td>VWR International</td><td>732-3207</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Corning</td><td>45000-446</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix mit HF-Puffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>F531L</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimin, verzweigt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>Puromycindihydrochlorid</td><td>Santa Cruz Biotechnologie</td><td>sc-108071A</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR-Aufreinigungskit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>SafeSeal Mikrozentrifugenröhrchen 1,5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.706</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid, 5 M Aqua Lösung, RNasefrei</td><td>Alfa Aesar</td><td>J60434.AE</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat (SDS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenvorsatzfilter PES 33mm 0,2 &mu; M</td><td>Fisher Scientific</td><td>15206869</td><td></td></tr><tr><td>TC Dish 100, Standard</td><td>Sarstedt</td><td>8,33,902</td><td></td></tr><tr><td>TC Plate 6 Well, Standard, F</td><td>Sarstedt</td><td>83,39,20,005</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Roche</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr></tbody></table>

duale crispr-interferenzstrategie zur gezielten gezielten behandlung synthetischer letaler wechselwirkungen zwischen nicht-kodierenden rnas in krebszellen

Dual CRISPR-Interference Strategy for Targeting Synthetic Lethal Interactions Between Non-Coding RNAs in Cancer Cells

Die Expressionskassetten von SadCas9-KRAB-MeCP2 und SpdCas9-KRAB-MeCP2 wurden gleichzeitig mittels Transduktion mit gleichen Mengen an Lentiviren in 501-mel-Zellen integriert. Da dieses CRISPRi-Protokoll auf der Expression von dCas9-KRAB-MeCP2-Varianten beruht, ist die Western-Blot-Analyse ideal, um deren Vorhandensein auf Proteinebene zu bestätigen. Nach der Anreicherung der positiv transfizierten Zellen wurden Proben für die Western-Blot-Analyse entnommen, um das Vorhandensein der dCas9-KRAB-MeCP2-Orthologe zu bestätigen. Nach erfolgreicher Transduktion wird eine einzelne Bande erwartet, die dem SpdCas9-KRAB-MeCP2-Fusionsprotein (202 kDa) und dem SadCas9-KRAB-MeCP2-Fusionsprotein (170 kDa) entspricht, und wurde, wie in Abbildung 2A gezeigt, unter Verwendung von Antikörpern bestätigt, die für die jeweiligen Cas9-Orthologe spezifisch sind. Wenn ein Western Blot jedoch nicht möglich ist, kann die qPCR verwendet werden, um die Fusionsproteine auf mRNA-Ebene zu verifizieren.
Nachdem 501-Mel-Zellen erzeugt worden waren, die die funktionellen Repressoren stabil exprimierten, wurde eine zweite lentivirale Transduktion unter Verwendung eines dualen gRNA-Vektors durchgeführt. Es wurde bereits gezeigt, dass RP11 und XLOC in Kurzzeitkulturen von metastasiertem Melanom hochreguliert sind, und individuelles CRISPRi-Targeting zeigte ihren Einfluss auf die Proliferation und das Zellüberleben28. Daher wählten wir dieses lncRNA-Paar für die Evaluierung als Proof-of-Concept-Kombination aus synthetischer letaler nicht-kodierender RNA aus, wobei wir einen kumulativen, leicht beobachtbaren Wachstumsphänotyp in den modifizierten Zellen erwarteten.
Um die Auswirkungen von dualem CRISPRi auf Krebszellen mit Hilfe von Viabilitätsassays zu untersuchen, müssen beide zielgerichteten lncRNAs effektiv unterdrückt werden. Die qPCR ist die am besten geeignete Methode, um diese Repression durch Messung der Transkriptspiegel zu bestätigen. Wir haben die Funktionalität des entwickelten dualen CRISPRi-Protokolls evaluiert, indem wir die RNA-Spiegel bestimmt und die Zellviabilität untersucht haben, wenn das potenziell letale RP11- und XLOC-Paar angegriffen wird. Daher wurden verschiedene gRNAs, die auf RP11 und XLOC abzielen, eingeführt, um die Ziel-RNA-Spiegel zu reduzieren. Die Repression von RNA wurde unter Verwendung von zielspezifischen gRNAs für SadCas9-KRAB-MeCP2 oder SpdCas9-KRAB-MeCP2 untersucht, die einzeln und in Kombination mit einer Kontroll-gRNA getestet wurden, die auf Rosa26 abzielt (siehe Abbildung 2B). Obwohl gRNAs, die individuell auf XLOC oder RP11 abzielen, ihre jeweiligen Ziele effektiv unterdrückten, wurde ein gleichzeitiger Knockdown von XLOC und RP11 nur mit dem XLOC-sa/RP11-sp-Paar erreicht.
Da sowohl die XLOC- als auch die RP11-RNA-Spiegel in der 501-Mel-Zelllinie mit dem ausgewählten XLOC-sa/RP11-sp-gRNA-Paar erfolgreich reduziert werden konnten, wurde ein dualer lncRNA-Repressions-Viabilitätstest durchgeführt (siehe Abbildung 2C). Nach 5 Tagen betrug die Zellviabilität 81 % und 89 % der Rosa26-Kontrolle, wenn die Ziel-gRNAs einzeln verwendet wurden. Die Kombination von RP11-sp und XLOC-sa führte zu einer weiteren signifikanten Reduktion im Vergleich zu RP11-sp allein, wobei die Zellviabilität bei 59% der Rosa26-Kontrolle lag.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67752/67752fig02.jpg"> 
Abbildung 2: Funktionsweise des dualen lncRNA-Repressionssystems. (A) Die Western-Blot-Analyse wurde durchgeführt, um die dCas9-KRAB-MeCP2-Varianten in modifizierten 501-mel-Zellen mit anti-Cas9-Antikörpern nachzuweisen. Als Kontrolle wurden 501-Mel-Wildtyp-Zellen (WT) ohne Transduktion verwendet (siehe Ergänzende Abbildung 3, Ergänzende Abbildung 4, Ergänzende Abbildung 5, Ergänzende Abbildung 6 für den Roh-Blot). (B) qPCR-basierte Analyse von RP11- und XLOC-RNA-Spiegeln im Vergleich zu Rosa26-Kontrollzellen nach der Transduktion von dualen gRNAs in modifizierte 501-mel-Zellen. GAPDH wurde als Haushalts-Gen verwendet. Die Daten sind als Mittelwert ± SD ausgedrückt. (C) Der duale lncRNA-Repressions-Viabilitätsassay wurde nach Integration von dualen gRNAs in modifizierte 501-mel-Zellen in drei unabhängigen Transduktionen durchgeführt. Die Lumineszenzwerte wurden auf die Rosa26-Kontrolle normiert. Die Viabilitätsergebnisse werden als Mittelwert (n = 3) ± SEM ausgedrückt. Es wurde ein ungepaarter t-Test durchgeführt. Ein Sternchen (*) zeigt eine signifikante Differenz bei p &lt; 0,05 an. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/67752fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzende Abbildung 1: Plasmidkarte. Die Karte wurde mit Benchling (https://benchling.com/) erstellt. Die im Protokoll verwendeten Plasmide wurden aus Addgene #96921 und #110824 modifiziert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Figure%201.tif" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Abbildung 2: Ergänzende Abbildung 2: Western-Blot-Analyse von dCas9-KRAB-Ausdruck. (A) SadCas9-KRAB-Expression in 501-Mel-Zellen 6 Tage nach der Transfektion. (B) Die sequentielle Transduktion von SadCas9-KRAB und SpdCas9-KRAB in 501-mel-Zellen führte 3 Wochen nach der Transfektion zu einer verminderten SadCas9-KRAB-Expression. (C) Die gleichzeitige Transduktion von SadCas9-KRAB und SpdCas9-KRAB in 501-Mel-Zellen führte 3 Wochen nach der Transfektion zu einer verminderten SadCas9-KRAB-Expression. (D) Die SpdCas9-KRAB-Expression konnte nach gleichzeitiger Transduktion von SadCas9-KRAB und SpdCas9-KRAB beobachtet werden. LV. Die Menge der verwendeten Lentiviren in μL. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Figure%202.tif" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Abbildung 3: Western-Blot-SaCas9-KRAB-Rohdaten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Figure%203_SaCas9-KRAB%20raw%20data.tif" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Abbildung 4: Western-Blot-SpCas9-KRAB-Rohdaten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Figure%204_SpCas9-KRAB%20raw%20data.tif" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Abbildung 5: GAPDH_SpCas9-KRAB-Rohdaten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Figure%205_GAPDH_SpCas9-KRAB%20raw%20data.tif" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Abbildung 6: GAPDH_SaCas9-KRAB-Rohdaten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Figure%206_GAPDH_SaCas9-KRAB%20raw%20data.tif" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Tabelle 1: Verwendete Guide-RNA-Sequenzen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Table%201_RE.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Tabelle 2: Verwendete DNA-Sequenzen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Table%202_RE.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Datei 1: FASTA-Datei von dual-grna-zeo-gfp. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Data%201_dual-grna-zeo-gfp.fasta" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Datei 2: FASTA-Datei von dSpCas9-krab-mecp2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Data%202_dSpCas9-krab-mecp2.fasta" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Datei 3: FASTA-Datei von dSaCas9-krab-mecp2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Data%203_dSaCas9-krab-mecp2.fasta" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Duale CRISPR-Interferenzstrategie zur gezielten gezielten Behandlung synthetischer letaler Wechselwirkungen zwischen nicht-kodierenden RNAs in Krebszellen

Long non-coding RNAs (lncRNAs) represent a vast and functionally diverse class of RNA molecules, with over 100,000 predicted in the human genome. Although ...

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Research

Forschung

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Genetics

Genetik

CRISPR/Cas9 ist ein robustes System, um Störungen von Genen und genetischen Elementen zu erzeugen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur effizienten Erzeugung genomischer Deletionen in Säugetierzelllinien mittels CRISPR/Cas9.

Generierung von Genomic Löschungen in Säugerzelllinien über CRISPR / Cas9

Der CRISPR / Cas9 System bietet das Potenzial, um gezielte Genom Bearbeitung zugänglich und erschwinglich für die wissenschaftliche Gemeinschaft. Dieses Protokoll soll zeigen, wie Viren zu schaffen, die ein Gen von Interesse unter Verwendung des CRISPR / Cas9 System Knockout wird, und sie dann stereotaxically in die erwachsenen Maus Gehirn zu injizieren.

Planung, Verpackung und Lieferung von hohen Titern CRISPR Retro und Lentiviren über stereotaktische Injektion

Jüngste Fortschritte in der Fähigkeit, somatische Zelllinien genetisch zu manipulieren, haben großes Potenzial für grundlegende und angewandte Forschung. Hier präsentieren wir zwei Ansätze für CRISPR / Cas9-produzierte Knockout-Produktion und Screening in Säugetierzelllinien, mit und ohne Verwendung von selektierbaren Markern.

Selektionsabhängige und unabhängige Erzeugung von CRISPR / Cas9-vermittelten Gen-Knockouts in Säugetierzellen

Dieses Protokoll beschreibt den Workflow eines CRISPR/Cas9-basierte Gens editing-System für die Reparatur von Punktmutationen in Säugetierzellen. Hier verwenden wir einen kombinatorischen Ansatz zur gen Bearbeitung mit einer detaillierten Follow-on experimentelle Strategie zur Messung von Indel Bildung an die Ziel-Site-Analyse im Wesentlichen vor-Ort-Mutagenese.

Eine Standardmethodik, vor-Ort-Mutagenität als Funktion der Punktmutation Reparatur katalysiert durch CRISPR/Cas9 und SsODN in den menschlichen Zellen zu untersuchen

Die CRISPR-Cas9-Technologie bietet eine effiziente Methode, um das Säugetiergenom in jedem Zelltyp präzise zu bearbeiten, und stellt ein neuartiges Mittel zur Durchführung genomweiter genetischer Screens dar. Ein detailliertes Protokoll, in dem die Schritte erläutert werden, die für die erfolgreiche Durchführung von gepoolten genomweiten CRISPR-Cas9-Bildschirmen erforderlich sind, finden Sie hier.

Gepoolte CRISPR-basierte genetische Screens in Säugetierzellen

Die direkte Lieferung von vormontierten Cas9/Guide-RNA-Ribonukleoprotein-Komplexen ist ein schnelles und effizientes Mittel zur Genombearbeitung in hämatopoetischen Zellen. Hier nutzen wir diesen Ansatz, um einen RUNX1 intronic Schalldämpfer zu löschen und die Transkriptionsreaktionen in OCI-AML3-Leukämischen Zellen zu untersuchen.

Untersuchung der Transkriptionsrolle eines RUNX1 Intronic Schalldämpfers durch CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in akuten myeloischen Leukämiezellen

Große genetische Screens in Modellorganismen haben zur Identifizierung negativer genetischer Interaktionen geführt. Hier beschreiben wir einen Datenintegrations-Workflow, der Daten aus genetischen Screens in Modellorganismen verwendet, um Arzneimittelkombinationen abzugrenzen, die auf synthetische tödliche Wechselwirkungen bei Krebs abzielen.

Ein Datenintegrations-Workflow zur Identifizierung von Arzneimittelkombinationen, die auf synthetische tödliche Wechselwirkungen abzielen

Dieses Protokoll beschreibt einen Hochdurchsatz-Cluster-Clustered-Regular-Interspaced-Short-Palindromic-Repeats-Gen-Editing-Workflow für die microRNA-Cluster-Netzwerkanalyse, der die schnelle Generierung eines Panels genetisch veränderter Zelllinien mit einzigartigen miRNA-Cluster-Deletionskombinationen von bis zu 35 kb innerhalb eines einzigen Experiments ermöglicht.

CRISPR-Gen-Editing-Tool für die MicroRNA-Cluster-Netzwerkanalyse

Ein wesentliches Hindernis für Technologien wie CRISPR sind die Off-Target-Ereignisse, die lebenswichtige Gene stören können. "Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing" (CIRCLE-seq) ist eine Technik zur Identifizierung unbeabsichtigter Spaltstellen. Diese Methode bildet die genomweite Aktivität von CRISPR-Cas9 mit hoher Sensitivität und ohne Verzerrung ab.

CIRCLE-Seq zur Abfrage von Off-Target-Gen-Editing

Die THP-1-Zelllinie wird häufig als Modell verwendet, um die Funktionen menschlicher Monozyten/Makrophagen in verschiedenen biologiebezogenen Forschungsbereichen zu untersuchen. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für effizientes CRISPR-Cas9-basiertes Engineering und Einzelzell-Klonisolierung, das die Produktion robuster und reproduzierbarer phänotypischer Daten ermöglicht.

Elektroporationsbasierter CRISPR-Cas9-vermittelter Gen-Knockout in THP-1-Zellen und Einzelzell-Klonisolierung

Es wird ein akribischer und strukturierter Ansatz verfolgt, um resistente und empfindliche Strahlengene durch die Anwendung einer genomweiten CRISPR/Cas9-Screening-Methode auszuwählen. Dieses Protokoll hat auch das Potenzial, als vielseitiger Rahmen für andere Forschungsvorhaben zu dienen, die die Mechanismen der Resistenz gegen klinisch verabreichte chemische Arzneimittel untersuchen.

Genomweiter CRISPR-Screen zur Entschlüsselung strahlenempfindlicher und strahlenresistenter Gene

Erfahren Sie die duale CRISPRi-Strategie zur kombinatorischen Gen-Knockdown in Melanomzellen. Diese Methode identifiziert synthetisch letale lncRNA-Wechselwirkungen für neue Krebstherapien.

Duale CRISPR-Interferenzstrategie zur gezielten gezielten Behandlung synthetischer letaler Wechselwirkungen zwischen nicht-kodierenden RNAs in Krebszellen (Video) | JoVE Journal

Duale CRISPR-Interferenzstrategie zur gezielten gezielten Behandlung synthetischer letaler Wechselwirkungen zwischen nicht-kodierenden RNAs in Krebszellen

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