Duale CRISPR-Interferenzstrategie zur gezielten gezielten Behandlung synthetischer letaler Wechselwirkungen zwischen nicht-kodierenden RNAs in Krebszellen

Unser Ziel ist es, kritische Netzwerk-Hubs systematisch zu identifizieren und therapeutisch zu adressieren, wobei der Schwerpunkt auf nicht-kodierenden RNAs bei Krebs liegt. Die aktuelle experimentelle Herausforderung unseres Ansatzes liegt in der kombinatorischen Fähigkeit, die erforderlich ist, um eine große Anzahl von Genen parallel zu generieren und zu screenen. Unser Ziel ist es, den Weg für die Identifizierung neuartiger kombinatorischer nicht-kodierender RNA-Ziele oder medikamentöser Strukturen zu ebnen, um Resistenzen und therapeutische Flucht zu umgehen.

In Zukunft werden wir dieses Proof-of-Concept-Tool in groß angelegte kombinatorische Bibliotheksscreenings umsetzen, möglicherweise in Kombination mit RNA-bindenden Proteinen, sowohl in vitro als auch in vivo. Zu Beginn der Zählung von Lenti-X 293T HEK-Zellen mit Trypanblau-Farbstoff in einem Hämozytometer. Platte 4 mal 10 hoch 6 Lenti-X 293T HEK-Zellen pro 10 Zentimeter Platte und inkubieren, um am nächsten Tag eine Konfluenz von etwa 80 % zu erreichen.

Ab diesem Schritt arbeiten Sie in einem Labor der Klasse 2. Mischen Sie 500 Mikroliter eines geeigneten Transfektionsmediums mit dem Transfervektor, dem Hüllplasmid und dem pPAX2-Vektor. Inkubieren Sie die Mischung fünf Minuten lang bei Raumtemperatur.

Mischen Sie in einem separaten Röhrchen 500 Mikroliter reduziertes Serummedium mit 36 Mikrolitern PEI-Reagenz in einer Konzentration von 1 Milligramm pro Milliliter. Inkubieren Sie die Mischung fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Kombinieren Sie die beiden Mischungen und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Geben Sie nun die Mischung vorsichtig tropfenweise in das sechs Milliliter enthaltende Zellmedium und inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid. Nach 12 bis 15 Stunden entsorgen Sie das Medium mit einer serologischen Pipette in eine autoklavierbare Abfallflasche. Spülen Sie Verbrauchsmaterialien, einschließlich serologischer Pipetten und Pipettenspitzen, mit einer Desinfektionslösung, bevor Sie sie im Autoklavenabfall entsorgen.

Geben Sie mit einer neuen Pipette fünf Milliliter frisches DMEM in die transfizierten Zellen. Um Lentiviren zu ernten, übertragen Sie den Überstand mit einer serologischen Pipette 48 Stunden nach der Transfektion in ein kanonisches 50-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie dann 5 Milliliter frisches Medium in die Zellen und inkubieren Sie sie weitere 24 Stunden lang.

Bewahren Sie die Tube im Kühlschrank auf. Wiederholen Sie nach der Inkubation die Entnahme von Lentiviren und legen Sie sie mit der zuvor entnommenen Probe zusammen. Nach der dritten Ernte lagern die kombinierten Überstände aller drei Ernten bei vier Grad Celsius bis zur Filtration und Zentrifugation.

Zentrifugieren Sie den kombinierten Überstand 5 Minuten lang bei 500 g und 4 Grad Celsius in aerosoldichten Behältern und Rotoren, die für Organismen der Risikogruppe 2 zugelassen sind, und filtrieren Sie den Überstand dann durch sterile 0,2-Mikrometer-Spritzenvorsatzfilter in Zellkulturqualität. Der gefilterte Überstand wird bei 1000 g und vier Grad Celsius unter Verwendung einer Zentrifugalfiltereinheit mit einem Molekulargewicht von 100 Kilodalton auf etwa 500 Mikroliter konzentriert. Virusaliquoten von 50 bis 100 Mikrolitern bis zur weiteren Verwendung bei minus 80 Grad Celsius lagern.

501-mel-Zellen werden in einer Sechs-Well-Platte bei 2 mal 10 hoch 5 Zellen pro Well mit einem endgültigen Kulturvolumen von 2 Millilitern einen Tag vor der Transduktion plattiert. Das Nährmedium wird durch 2 Milliliter vorgewärmtes DMEM ersetzt, das mit Polybren in einer Endkonzentration von 6 Mikrogramm pro Milliliter versetzt wird. Arbeiten Sie ab diesem Schritt in einem Labor der Klasse 2.

Geben Sie 50 Mikroliter präparierte SPD- und SAD-Lentiviren gleichzeitig tropfenweise in die Zellen. Schütteln Sie die Platte vorsichtig und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius in einer Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid. 16 Stunden nach der Transduktion wird das Medium mit einer serologischen Pipette in eine autoklavierbare Flasche gegeben.

Fügen Sie 2 Milliliter frisches Medium hinzu, das 10 Mikrogramm pro Milliliter Blasticidin und 2 Mikrogramm pro Milliliter Puromycin enthält. Wiederholen Sie den Schritt des Mediumaustauschs nach zwei Tagen und behandeln Sie die transduzierten Zellen unter S1-Bedingungen sieben Tage nach der Transduktion. Seed 0,1 mal 10 hoch 5 Zellen mit stabilem transfiziertem SadCas9 KRAB und Sp-dCas9-KRAB sieben Tage nach der Transduktion in einer 96-Well-Platte mit 100 Mikrolitern vorgewärmtem DMEM.

Ersetzen Sie das Medium am Tag der Transduktion durch 100 Mikroliter vorgewärmtes DMEM, das mit Polybren bei 6 Mikrogramm pro Milliliter ergänzt wird. Geben Sie das entsprechende Volumen an Lentiviren in die Zellen und inkubieren Sie die Platte. Ersetzen Sie das Medium nach 16 Stunden durch frisches Medium, das Zeoin, Blasticidin und Puromycin enthält.

Führen Sie die Lumineszenzdetektion fünf Tage nach der Transduktion mit einem Zellviabilitätsassay gemäß den Anweisungen des Herstellers durch. Westliche Blutanalysen bestätigten die erfolgreiche Expression von SpdCas9- und SadCas9-Fusionsproteinen in Transducer-501-mel-Zellen. Die quantitative Polymerase-Kettenreaktionsanalyse zeigte einen effektiven Knockdown einzelner langer nicht-kodierender RNAs RP11 und XLOC unter Verwendung spezifischer Guide-RNAs, aber nur das XLOC-sa- und RP11-sp-Paar unterdrückte beide Ziele gleichzeitig.

Die duale Repression von RP11 und XLOC unter Verwendung des GRNA-Paares XLOC-sa und RP11-sp reduzierte die Lebensfähigkeit der 501-Mel-Zellen im Vergleich zur Kontrolle signifikant auf 59 %.