Eine effiziente Methode zur Extraktion von Epithelien aus menschlichen Eileitern für Einzelzellanalysen

Unser Forschungsschwerpunkt liegt auf dem Verständnis und der Bekämpfung von Chemoresistenzen bei Eierstockkrebs. Unser Ziel ist es, Mechanismen und Zellsubpopulationen zu entdecken, die Resistenzen antreiben, sowie neue Ziele, um diese aggressiven Populationen auszurotten.

Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung erleichtert die Charakterisierung von Subpopulationen in heterogenen Ovarialtumoren. Wir nutzen nicht-krebsartige Eileiterepithelzellen als normale Ursprungszelle für die Analyse von Eierstockkrebs.

Die effiziente Isolierung von Epithelzellen des Eileiters in eine angereicherte Einzelzellsuspension wird dazu beitragen, die Entstehung von Erkrankungen bei hochgradigem serösem Eierstockkrebs besser zu verstehen. Diese mechanische und enzymatische Verdauungstechnik bietet ein effizienteres Verfahren zur Extraktion einer angereicherten Einzelzellsuspension lebensfähiger Eileiterepithelzellen.

[Erzähler] Sammeln Sie zunächst frische menschliche Eileiter in einem 15- oder 50-Milliliter-Röhrchen mit Dissoziationsmedium und legen Sie das Röhrchen auf Eis. Übertragen Sie die Eileiter in eine sterile Petrischale mit frischem Dissoziationsmedium und legen Sie die Probe unter ein Präpariermikroskop. Nun wird mit einer Zange mit feiner Spitze und einer Vannas-Tübinger Schere Fett, Bindegewebe und die Gefäße, die die Schläuche umgeben, abgetrennt. Schneiden Sie dann mit einer Schere die Kronenebene der Eileiter zu kleinen Zylindern mit drei bis fünf Millimetern Durchmesser durch. Verwenden Sie eine feine=spitze Pinzette, um das Gewebe beim Schneiden zu stabilisieren. Saugen Sie das Dissoziationsmedium vorsichtig aus der Schale mit den Gewebestücken ab. Waschen Sie die Taschentücher zweimal mit zwei Millilitern kaltem 1x PBS und drehen Sie die Platte leicht. Nach dem Aspirieren des PBS inkubieren Sie die Gewebestücke fünf Minuten lang in kaltem fünf Millimolar EDTA bei Raumtemperatur. Suspendieren Sie die Gewebefragmente in kalter 1%iger Trypsin Hanks Balanced Salt Solution und inkubieren Sie sie 40 Minuten lang bei vier Grad Celsius. Aspirieren Sie die 1%ige Trypsin Hanks Balanced Salt Solution und waschen Sie die Gewebestücke zweimal in kaltem Dissoziationsmedium, um das Trypsin zu inaktivieren. Inkubieren Sie die Gewebefragmente in zwei Millilitern Dissoziationsmedium mit 0,4 Milligramm DNase für mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur. Halten Sie unter einem Präpariermikroskop, während Sie sich noch in DNase-Medien befinden, ein Fragment des Eileiters mit einer Pinzette, so dass das Lumen parallel zum Boden der Schale ist. Drücken Sie mit einer Pinzette wiederholt auf das Gewebe, um Epithelzellen aus dem Lumen auszustoßen. Bestätigen Sie die Freisetzung eines Zellhalos um das Gewebe. Übertragen Sie die medienhaltigen Zellen in ein steriles 15-Milliliter-Röhrchen. Waschen Sie die Petrischale zweimal mit Dissoziationsmedien und kombinieren Sie die Waschungen in derselben Tube. Entsorgen Sie die restlichen Fragmente des Stromarohrs. Um die Zellen zu ernten, zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei 500 g. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter Dissoziationsmedium. Mischen Sie nun 10 Mikroliter Zellsuspension mit einem gleichen Volumen Trypanblau. Pipettieren Sie 10 Mikroliter der Mischung in einen Kammerzählobjektträger und führen Sie ihn in einen Zellzähler ein, um die Zellzahl zu bestimmen. Resuspendieren Sie die Zellen in neun Millilitern Dissoziationsmedien, die Kollagenase Typ 1 und DNase enthalten. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für 30 bis 45 Minuten in einem Orbitalschüttler, der auf 200 U/min eingestellt ist. Um die Zellen zu ernten, zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 500 g. Nachdem Sie den Überstand abgesaugt haben, resuspendieren Sie das Pellet in fünf Millilitern Dissoziationsmedium, um die Kollagenase abzuwaschen. Die Zellsuspension wird durch ein 100-Mikrometer-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Röhrchen geleitet und das Filtrat bei 500 g fünf Minuten lang zentrifugiert. Wenn das Zellpellet rot erscheint, bereiten Sie einen Erythrozyten-Lysepuffer vor, um die roten Blutkörperchen zu lysieren. Aspirieren Sie das Medium aus dem Pellet, fügen Sie fünf Milliliter des verdünnten Erythrozyten-Lysepuffers hinzu und inkubieren Sie die Probe drei Minuten lang auf Eis. Um die Erythrozytenlyse zu stoppen, geben Sie 45 Milliliter 1x PBS in das Röhrchen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 500 g für fünf Minuten. Nach der Ernte und Resuspendierung der Zellen in einem Milliliter Dissoziationsmedium mischen Sie 10 Mikroliter der Zellsuspension mit einem gleichen Volumen Trypanblau. Pipettieren Sie 10 Mikroliter der Mischung in einen Zählobjektträger der Kammer und setzen Sie ihn in den Zellzähler ein. Die durchflusszytometrische Analyse bestätigte die Isolierung einer lebensfähigen und angereicherten Epithelzellpopulation aus Eileitergewebe mit einer durchschnittlichen Lebensfähigkeit von 82%. Nach dem Ausscheiden von CD45-positiven Immunzellen machten EpCAM-positive Epithelzellen durchschnittlich 80 % der Probe aus, während die Kontamination mit CD10-positiven Stromazellen mit 7,8 % minimal war. Isolierte Epithelzellen bildeten in 2D-Kultur nach vier- bis sechstägiger Beschichtung adhärente kopfsteinpflasterartige Cluster, was die Epithelidentität bestätigt. Die Immunchemie zeigte, dass die meisten kultivierten Zellen EpCAM und PAX8 exprimierten, wobei nur wenige Vimentin-positive Zellen vorhanden waren. Flimmerzellen waren in Kultur vorhanden.