Anwendung eines neuartigen Hyaluron-Hydrogels für die dreidimensionale Follikelkultur und Methodik für die Kryokonservierung von Ovarialfollikeln in der Maus

Diese Forschung konzentrierte sich auf die Entwicklung eines 3D-Kultursystems für das In-vitro-Follikelwachstum und die Eizellreifung. Die Schaffung eines solchen Systems unter Verwendung von Komponenten der nativen extrazellulären Matrix einer Zelle wird die Follikelentwicklung fördern. Die größte Herausforderung besteht darin, das Wissen aus Tiermodellen auf die menschliche Follikelkultur anzuwenden.

Der Zugang zu menschlichem Eierstockgewebe ist begrenzt. Und menschliche Follikel benötigen eine deutlich längere Zeit in Kultur, um eine Eizellreifung zu erreichen. Das in dieser Studie entwickelte 3D-Kulturmodell kann besonders nützlich für die Kultivierung menschlicher Ovarialfollikel sein, da es die Beibehaltung der 3D-Architektur während der verlängerten Zeit ermöglicht, die in der Kultur für die Eizellreifung benötigt wird.

Besorgen Sie sich zunächst Eierstöcke von 10 bis 14 Tage alten B6D2F1-Mauswelpen für den Eingriff. 6 Milliliter voräquilibriertes Follikelkulturmedium (FCM) in zwei 60-Millimeter-Schalen pipettieren, mit Mineralöl überziehen und inkubieren. Pipettieren Sie 1 Milliliter Kollagenase in die mittlere Vertiefung der Schale und 3 Milliliter Eierstockgewebe oder OT-Medien in die äußere Vertiefung.

Bewegen Sie die Eierstöcke in die Kollagenaselösung. Bewegen Sie am Ende der Kollagenase-Inkubation die mit Kollagenase behandelten Eierstöcke zum Spülen in die äußere Vertiefung. Wechseln Sie die Mikropipetten und geben Sie die Eierstöcke in eine frische Schale, die mit OT-Medium gefüllt ist.

Um die Follikel zu gewinnen, aspirieren und stoßen Sie enzymbehandeltes Eierstockgewebe wiederholt durch Pipettenspitzen aus, die in verschiedenen Größen geschnitten sind. Mechanisches Teasern des Gewebes mit 27-Gauge-Nadeln bis zur Freisetzung von Follikeln. Untersuchen Sie unter einem Präpariermikroskop bei 40-facher Vergrößerung und entnehmen Sie sekundäre präantrale Follikel mit einer zentral gelegenen Eizelle, die in einer intakten Basalmembran eingeschlossen ist, in einer frischen OP-Schale.

Stellen Sie die FCM2-Schale für 60 Minuten in den Inkubator, bevor Sie mit dem Einbetten beginnen. Machen Sie zwei 25-Mikroliter-Tropfen HA-Gel ohne Wasserstoffperoxid zum Spülen auf den Deckel. Bewegen Sie Follikel oder Follikelcluster, die eingebettet werden sollen, aus der FCM-Schale in einen Tropfen des Hyaluronans oder HA-Gels, um sie frei von Kulturmedium zu spülen.

Stellen Sie die FCM-Schale wieder unter den Bubbler, um sie zu begasen. Zum Einbetten von Follikeln geben Sie 1 Mikroliter 0,03%igen Wasserstoffperoxidtropfen auf den Deckel einer 60-Millimeter-Schale. Fügen Sie nun 25 Mikroliter 3 Milligramm pro Milliliter HA-Gel hinzu und mischen Sie.

Pipettieren Sie etwa acht bis 10 Mikroliter des HA-Wasserstoffperoxid-Gemisches in zwei separate Vertiefungen der Kulturschale mit acht Vertiefungen. Und übertragen Sie schnell die Follikel, Follikelcluster oder Eierstockgewebefragmente in die Mitte jedes Tropfens. Stellen Sie sicher, dass sich keine Blasen im Tropfen befinden.

Geben Sie nach drei Minuten 100 Mikroliter vorequilibriertes Follikelkulturmedium in jede Vertiefung. Mit warmem, vorequilibriertem Mineralöl überziehen und die Schale inkubieren. Bereiten Sie die Ausrüstung und die Lösungen vor, die für den Vitrifikationsprozess erforderlich sind.

Positionieren Sie den RI-Träger in den Schlitz in der Kryobox mit flüssigem Stickstoff. Geben Sie zwei Tropfen vorgewärmte Vitrifikationslösung 1 oder VS1 nebeneinander auf den Deckel einer 60-Millimeter-Schale in der Nähe der Oberseite. Geben Sie nun zwei Follikel in den ersten Tropfen, spülen Sie sie aus und bewegen Sie sie schnell in den zweiten Tropfen VS1 für eine fünfminütige Inkubation.

Während die Follikel inkubieren, machen Sie drei VS2-Tropfen direkt unter den VS1-Tropfen. Bewegen Sie dann die Follikel innerhalb von 60 Sekunden schnell nacheinander durch die drei VS2-Tropfen. Für die Vitrifikation nehmen Sie die Follikel aus VS2.

Betrachten Sie den RI-Träger unter dem Präparierbereich. Und passen Sie den Fokus an, um das winzige Loch im Plastikstab zu visualisieren. Legen Sie Follikel mit minimaler Flüssigkeit in das Loch.

Lassen Sie das Plastikstäbchen in den vorgekühlten äußeren Strohhalm fallen. Und verwenden Sie ein Ultraschallsiegel, um den Strohhalm zu verschließen. Legen Sie den Strohhalm in einen Becher, der am Kryostock befestigt ist.

Decken Sie das Rohr mit einer Schutzhülle aus Kunststoff ab und tauchen Sie es in flüssigen Stickstoff. Für die offene Vitrifikation des Trägers bereiten Sie den Träger vor, indem Sie den CL-Stiel aus Metall in die magnetisierte Fläschchenkappe einführen, um einen festen Halt zu gewährleisten. Platzieren Sie ein Gestell in der Kryobox, um Kryo-Fläschchen aufzunehmen, und stellen Sie sicher, dass sich flüssiger Stickstoff unter der Oberseite der Fläschchen befindet.

Füllen Sie ein magnetisiertes, erfundenes Kryo-Fläschchen mit flüssigem Stickstoff und legen Sie es in das Rack. Fassen Sie den offenen CL-Träger mit einem Magnetstab an der angebrachten Magnetkappe. Tauchen Sie den CL-Träger in einen separaten Tropfen VS2, um einen Kryoprotektivfilm zu erzeugen.

Nehmen Sie alle Follikel oder Follikelcluster auf und legen Sie sie mit minimaler Flüssigkeit auf die Folie. Tauchen Sie den CL sofort in das mit flüssigem Stickstoff gefüllte Kryofläschchen, um die Probe zu vitifizieren. Legen Sie das Kryo-Fläschchen auf den Kryo-Stock und decken Sie es dann mit einer Plastikhülle ab.

Tauchen Sie das Rohr in einen Vorratstank für flüssigen Stickstoff. Bereiten Sie ein Gericht in der Mitte der Vertiefung mit 3 Millilitern voräquilibriertem FCM in der äußeren Vertiefung und 1 Milliliter in der mittleren Vertiefung zu. Nachdem Sie das Medium mit Öl überzogen haben, stellen Sie die Schale unter den Bubbler, um sie zu begasen.

0,5 Milliliter der auf 37 Grad Celsius voräquilibrierten Erwärmungslösungen WS1 und WS2 in zwei beschriftete Schalen in der Mitte der Vertiefung geben. Bringen Sie die Kryo-Rohre mit Proben aus dem Lagertank in eine mit flüssigem Stickstoff gefüllte Kryobox. Entfernen Sie zuerst die Kunststoffabdeckung des Rohrs.

Halten Sie dann den Strohhalm eingetaucht, nehmen Sie ihn aus dem Becher und schieben Sie ihn in den Halteschlitz in der Kryobox. Schneide den äußeren Strohhalm knapp über dem schwarzen Punkt ab. Heben Sie den inneren Kunststoffstab aus dem äußeren Strohhalm und tauchen Sie den Stab schnell in WS1 ein, wobei Sie ihn vorsichtig schwenken, um die Follikel innerhalb von 10 Sekunden zu entladen.

Nach zwei Minuten in WS1 verwenden Sie eine Mikropipette, um Follikel oder Follikelcluster für eine dreiminütige Inkubation auf WS2 zu übertragen. Übertragen Sie sie dann in eine FCM-Schale und inkubieren Sie die Follikel ein bis zwei Stunden lang in der Mitte, bevor Sie sie einbetten. Wiederholen Sie für die Erwärmung des offenen Trägers CL die Zubereitung der FCM- und WS-Schüssel. Füllen Sie das Kryorohr in eine Kryobox und entfernen Sie die Abdeckung des Kunststoffrohrs.

Heben Sie die Kappe des Kryofläschchens mit einem Magnetstab an, bis der Metallstiel des CL sichtbar ist. Fassen Sie die Kappe mit dem angebrachten CL-Träger mit dem Magnetstab an. Und tauchen Sie den CL schnell in WS1 ein und schwenken Sie, um Follikel innerhalb von 10 Sekunden zu entladen.

Das präantrale Follikelwachstum wurde in der dreidimensionalen Hyaluron-Gelkultur beibehalten, wobei die native Follikelarchitektur mit einem Antrum erhalten blieb, das am Tag 12 sichtbar war. Verkapselte Follikel in Hyaluronsäuregel zeigten eine radiale Expansion aufgrund der Granulosezellproliferation, wobei die Follikeldurchmesser im Laufe des Kulturzeitraums von etwa 139,8 Mikrometern auf 385,6 Mikrometer zunahmen. Ovulierte Metaphase-2-Eizellen wurden in der Nähe des Follikels nach dem Auslösen des humanen Choriongonadotropins gefunden.

Die Eizellen hatten einen Durchmesser von etwa 84,8 Mikrometern. Bei frischen Eierstöcken zeigten sowohl einzelne Follikel als auch Follikelcluster gute Reiferaten. Follikelcluster aus kryokonservierten Eierstöcken wiesen niedrigere Reifungsraten auf, was zu einer vorzeitigen Eizellextrusion führte.

Die isolierte Follikel-Kryokonservierung war wirksamer als die Konservierung ganzer Eierstöcke. Die Follikelvitrifikation auf beiden Trägern erzielte hohe Reifungsraten, unabhängig von Unterschieden in der Kühlgeschwindigkeit. Das offene CL-Trägersystem ermöglichte eine effiziente Kryokonservierung mehrerer Follikel und reduzierte so die Verarbeitungszeit.