Sexuelle Kreuzungen mit dem Mucoromyceten Phycomyces blakesleeanus

Hier stellen wir ein grundlegendes Protokoll für die Induktion der Paarung von P. blakesleeanus vor.

Unser Labor ist daran interessiert, die Evolution von Entwicklungsprogrammen bei filamentösen Pilzen zu erforschen. Wir sind neugierig, welche Gene an diesen seriellen morphologischen Übergängen beteiligt sind, die während der sexuellen Fortpflanzung stattfanden.

Da sich Pilzmyzelien radial ausdehnen, kommen verschiedene Teile des Myzels zu unterschiedlichen Zeiten in Kontakt und erfahren eine asynchrone sexuelle Fortpflanzung. Dies kann Genexpressionsstudien erschweren, die versuchen, die Genexpression mit einem bestimmten sexuellen Zelltyp zu verknüpfen. Unser Protokoll ermöglicht es uns, die Anzahl der interagierenden Zellen zu begrenzen und möglicherweise ein klares Genexpressionssignal zu liefern.

Unser Protokoll wird die Extraktion von RNA aus bestimmten Zellen während der sexuellen Fortpflanzung erleichtern und es uns ermöglichen, die Genfunktion mit einer spezifischen morphologischen Veränderung zu verknüpfen.

[Erzähler] Besorgen Sie sich zunächst Kulturen jedes Paarungstyps von Phycomyces blakesleeanus. Schneiden Sie mit einem Skalpell einen Teil des Vorderkantenmyzels aus den vorhandenen Kulturen ab und geben Sie das herausgeschnittene Myzel auf eine frische Platte aus 100 % Maismehl-Agar oder Kartoffel-Dextrose-Agar. Inkubieren Sie die Reinkulturen eine Woche lang bei 27 Grad Celsius unter einem 12-stündigen Lichtzyklus. Sobald Sporangiophoren vorhanden sind, wird eine sporulierende Reinkulturplatte mit 0,01 % Tween 20 in sterilisiertem deionisiertem Wasser unter Verwendung einer aseptischen Technik geflutet. Ziehen Sie dann mit einer P1000-Mikropipette einen Milliliter der Tween-20-Sporenmischung aus der Platte in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie das Mikrozentrifugenröhrchen 30 Sekunden lang in einer Minizentrifuge und dekantieren Sie den Überstand vorsichtig, ohne das Pellet zu stören. Wenn mehr Sporen benötigt werden, geben Sie einen weiteren Milliliter der Tween 20-Sporenmischung in dasselbe Mikrozentrifugenröhrchen und wiederholen Sie die Zentrifugation. Nachdem Sie eine geeignete Menge an Sporen erhalten haben, dekantieren Sie den Überstand und ersetzen Sie ihn durch 500 Mikroliter steriles deionisiertes Wasser. Verwenden Sie ein Hämozytometer, um die Konzentration der Sporen abzuschätzen. Richten Sie die Kreuzungen je nach Bedarf als Zwei-Wege-, Vier-Wege- oder Acht-Wege-Kreuze ein. Alternativ können Sie die Kreuzungen mit einem Skalpell direkt mit Vorderkantenmyzelien aus den Reinkulturen beimpfen. Schneiden Sie dann mit einer sterilisierten Rasierklinge oder einer Korklochbohrung einen Teil des Gewebes aus und geben Sie das herausgeschnittene Inokulum sofort auf ein frisches Medium. Für eine Vier-Wege-Kreuzung platzieren Sie ähnliche Paarungstypen gegenüber, während Sie einen komplementären Paarungstyp benachbaren. Platzieren Sie nun die Sporen oder Myzelien der Minus-Paarungstypen mindestens einen Zentimeter vom Rand einer Petrischale, die Kartoffel-Dextrose-Agar oder Maismehl-Agar enthält, gegenüber. Versiegeln Sie die Platten nach dem Impfen mit Parafilm. Legen Sie die Platten in einen sekundären Behälter. Inkubieren Sie die Platten bei 22 Grad Celsius im Dunkeln. Beobachten Sie die Platten täglich auf Anzeichen einer Paarung und machen Sie während des Kulturwachstums Fotos unter der Platte. Verfolgen Sie das wachsende Myzel im Laufe der Zeit. Abhängig von der Art und Formulierung des Mediums und der Formulierung sind die interagierenden komplementären Paarungstypen unter einem Präparierfernrohr auf Anzeichen einer Paarung zu untersuchen. Fotografieren Sie das interagierende Myzel mit einer Kamera oder einem Smartphone, das auf dem Präparierfernrohr montiert ist. Einen Tag nach der Inokulation zeigten Stämme, die auf Kartoffel-Dextrose-Agar angebaut wurden, eine stärkere gelbe Pigmentierung im Vergleich zu Stämmen, die auf Maismehl-Agar angebaut wurden. Zwei Tage nach der Inokulation wurden Paarungsstrukturen auf 100% Kartoffel-Dextrose-Agar beobachtet, nicht jedoch auf Maismehl-Agarplatten. Drei Tage nach der Inokulation unterstützten alle Formulierungen von Kartoffel-Dextrose-Agar die Paarung mit unterschiedlichen Dichten differenzierter Zelltypen. Vier Tage nach der Inokulation zeigten Stämme auf Kartoffel-Dextrose-Agar-Platten sowohl Paarungsreaktionen als auch die Bildung asexueller Sporangiophoren. Stämme auf Maismehl-Agar wiesen im Vergleich zu Kartoffel-Dextrose-Agar diffusere Myzelien und weniger Sporangiophoren auf. Auf 100% Kartoffel-Dextrose-Agar erschienen vier Tage nach der Inokulation oberirdische Strukturen als Masse undifferenzierter Zellen. Auf 25% Kartoffel-Dextrose-Agar erschienen die Zellen an der Paarungsstelle gut unterscheidbar und überwiegend in ähnlichen Entwicklungsstadien. Auf 50% Kartoffel-Dextrose-Agar wurde eine Mischung aus Zygosporen in der Luft und sich entwickelnden Progametangien beobachtet.