Direkte Kryosektion von Drosophila-Köpfen zur verbesserten Fluoreszenzfärbung und Immunfärbung des Gehirns

Unser Team untersucht Stoffwechsel-, Herz-, Muskelschlaf- und Alterungsstörungen mit Hilfe des Drosophila-Modells. In diesem Jove-Artikel wurde ein vereinfachtes Protokoll für die Verarbeitung von Hirngewebe beschrieben, einschließlich Enthauptung, Fixierung, Kryosektion, Färbung und Bildgebung. Meine Forschungsgruppe hat Pionierarbeit bei der Entwicklung des Drosophila-Modells geleistet, um verschiedene menschliche Krankheiten und das Altern zu untersuchen.

Wir haben auch Interventionen wie zeitlich begrenztes Füttern und Bewegung untersucht. Wir verwenden maschinelles Lernen, Omics und molekulare Ansätze, um Faktoren wie zirkadianen Rhythmus und Genetik zu untersuchen und ihren Einfluss auf die zelluläre Integrität, Physiologie und das Verhalten aufzudecken. Dieses vereinfachte Drosophila-Hirnforschungsprotokoll vermeidet komplexe Dissektionen, erfordert nur eine einhändige Ausführung und macht kostspielige konfokale Mikroskopie überflüssig, wodurch die Zugänglichkeit erhöht und die Abhängigkeit von Geräten verringert wird.

Holen Sie sich zunächst die Fliegen in Alterungsfläschchen, öffnen Sie dann das Ventil an der Kohlendioxidmatte und kippen Sie die Fliegen schnell auf die Matte, um ein Entweichen zu verhindern. Sobald die Fliegen größtenteils bewusstlos sind, positionieren Sie die Fliegen unter dem SZ61-Mikroskop, indem Sie die Matte unter die Objektivlinse bewegen. Passen Sie die Vergrößerung und den Fokus an, bis die Fliegen deutlich sichtbar sind und sich bequem enthaupten lassen.

Positionieren Sie die Klingen mit einer Federschere zwischen Brustkorb und Fliegenkopf und drücken Sie sie fest zusammen, um fünf bis 10 Fliegenköpfe pro Versuchsgruppe zu enthaupten. Legen Sie alle gebrauchten Fliegen wieder in ihr alterndes Fläschchen. Übertragen Sie die geköpften Fliegenköpfe vorsichtig mit einer Bürste in beschriftete 1,5-Milliliter-Röhrchen, die auf Eis gelegt werden.

Nachdem Sie die Röhrchen aus dem Eis genommen haben, pipettieren Sie 100 Mikroliter 4 % Paraformaldehyd und PBS in jedes Röhrchen, um sicherzustellen, dass alle Fliegenköpfe vollständig untergetaucht sind. Wenn die Köpfe an den Tubenwänden haften, drücken Sie sie vorsichtig mit einer Bürste nach unten oder klopfen Sie die Tube leicht gegen eine horizontale Fläche, um einen ordnungsgemäßen Kontakt mit der Lösung zu gewährleisten. Inkubieren Sie die Röhrchen dann 15 Minuten lang auf einem Orbitalschüttler bei mittlerer Einstellung.

Entsorgen Sie die Paraformaldehydlösung und ersetzen Sie sie durch PBS, wobei Sie sicherstellen, dass alle Fliegenköpfe untergetaucht sind. Nach der letzten Wäsche überträgst Du die Fliegenköpfe in eine 10%ige Saccharoselösung in PBS und stellst sicher, dass sie in das Röhrchen eingetaucht sind. Füllen Sie eine beschriftete Form zu ca. 50 % mit optimaler Schnitttemperatur oder OCT-Masse, damit sie sich in alle vier Ecken der Form ausbreiten kann.

Legen Sie die gesammelten festen Fliegenköpfe vorsichtig mit einer Bürste auf die Oberfläche des OCT-Compounds in der Form. Schieben Sie mit der Spitze der Pinzette jeden Kopf vorsichtig auf den Boden der Form und stellen Sie sicher, dass die Augen für einen Schnitt durch die Kronenebene nach unten ausgerichtet sind. Richten Sie alle Köpfe in den X-, Y- und Z-Dimensionen sorgfältig aus, um sicherzustellen, dass alle Schnitte alle experimentellen Gruppen gleichzeitig enthalten.

Nachdem Sie die Köpfe richtig ausgerichtet haben, legen Sie die Formen vorsichtig direkt in einen Gefrierschrank, der auf minus 20 Grad Celsius eingestellt ist, um sie einzufrieren. Sobald die Form größtenteils gefroren ist, fülle den restlichen Raum mit OCT-Masse. Tragen Sie für die Kryosektion der Form eine großzügige Menge OCT-Masse auf die Oberseite der Form auf, um den Spannbohrer an der Form zu befestigen.

Legen Sie den Bohrer flach darauf und lassen Sie ihn vollständig im Kryostaten einfrieren, was in der Regel fünf Minuten dauert. Lösen Sie dann den Bohrer und den OCT-Block aus der Form. Setzen Sie den Block in das Spannfutter ein, stellen Sie sicher, dass die richtige Ausrichtung von oben nach unten beibehalten wird, und ziehen Sie den Spannschlüssel fest, bis der Block sicher an seinem Platz sitzt.

Richten Sie den Block mit den Einstellknöpfen und den Spanntiefenreglern mit der Klinge aus. Stellen Sie die Schnittbreite des Kryostaten auf 20 Mikrometer ein und schneiden Sie jede Scheibe mit einer langsamen, gleichmäßigen Bewegung, während das Anti-Roll-Glas jede Scheibe erfassen kann. Erfassen Sie dann die Abschnitte mit warmen Folien, indem Sie die Folie an den engeren Rand des Abschnitts berühren und den Abschnitt auf die Folie aufsteigen lassen.

Lassen Sie die Objektträger mindestens 30 Minuten, aber nicht länger als eine Stunde bei Raumtemperatur trocknen. Nehmen Sie die kryosektionierten Drosophila-Fliegenköpfe und verwenden Sie eine Rasierklinge, um alle OCT-Reste an den Rändern des Objektträgers zu entfernen, so dass Platz für einen hydrophoben Rand bleibt. Zeichnen Sie dann mit einem hydrophoben Marker einen Rand um jede Folie und lassen Sie sie fünf Minuten trocknen.

Waschen Sie alle Objektträger dreimal jeweils fünf Minuten lang mit PBS, indem Sie vorsichtig auf den Objektträger pipettieren. Nach dem Waschen der Objektträger 3%BSA in Tris gepufferter Kochsalzlösung auf die Objektträger pipettieren und 30 Minuten bis eine Stunde inkubieren. Verwerfen Sie dann die Blockierungslösung und pipettieren Sie die primäre Antikörperlösung auf die Objektträger.

Inkubieren Sie den Antikörper über Nacht bei vier Grad Celsius oder eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit feuchten Tüchern, um ein Austrocknen zu verhindern. Verwerfen Sie die primäre Antikörperlösung und waschen Sie die Objektträger dreimal für jeweils fünf Minuten mit PBS. Geben Sie dann die sekundäre Antikörperlösung zu den Objektträgern und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur.

Nachdem Sie die Objektträger dreimal mit PBS gewaschen haben, lassen Sie nur eine kleine Menge PBS auf der Objektträger. Geben Sie anschließend mit einer 1000-Mikroliter-Pipette drei bis fünf Tropfen DAPI-haltiges Einbettmittel gleichmäßig über den Objektträger. Legen Sie einen Deckglas auf die Rutsche, um sicherzustellen, dass sich während des Platzierens keine Luftblasen bilden.

Gehen Sie vorsichtig mit den frisch montierten Dias um und lagern Sie sie liegend, bis das Montagemedium vollständig getrocknet ist. Wenn eine langfristige Lagerung erforderlich ist, versiegeln Sie die Ränder der Objektträger. Nehmen Sie so schnell wie möglich Bilder der Objektträger auf, um den Fluoreszenzzerfall zu minimieren.

Konzentrieren Sie sich während der Bildaufnahme auf jedes einzelne Motiv im selben Kanal, um die Konsistenz in allen Versuchsgruppen zu gewährleisten. Kalibrieren Sie die Belichtungen für jeden Kanal, um eine Überbelichtung in allen ausgewählten Kanälen zu vermeiden. Stellen Sie sicher, dass die ausgewählten Expositionen konstant bleiben und für alle Probanden geeignet sind, insbesondere zwischen verschiedenen Versuchsgruppen.

Die Expression des ApoE-Antikörper-Tags war eindeutig in Gehirnregionen von Elav+- und Elav-ApoE4-Proben lokalisiert. Die Lipidakkumulation wurde durch eine Nilrotfärbung angezeigt, die in den Hirnregionen beider Genotypen sichtbar war.