Zeitaufgelöste Fluoreszenzanisotropie von einzelnen Molekülen zur Charakterisierung der lokalen Flexibilität in Biomolekülen

Diese Forschung zielt darauf ab, die lokale Flexibilität und Dynamik von Biomolekülen auf Einzelmolekülebene unter Verwendung der zeitaufgelösten Fluoreszenzanisotropie im konfokalen Mikroskopiemodus zu untersuchen. Die Detektion und Lokalisierung einzelner Moleküle hat die Beobachtung von Biomolekülen ermöglicht, aber die Erfassung ihrer Dynamik erfordert andere Ansätze. Zeitaufgelöste Fluoreszenzmethoden helfen, diese Lücke zu schließen.

Gängige Werkzeuge für die experimentelle Untersuchung der biomolekularen Dynamik, einschließlich Einzelmolekül-Bund und NMR. Auf der Ebene einzelner Moleküle können verschiedene Analysen, die die Photon-für-Photon-Fluoreszenzemission verarbeiten, dazu gehören die zeitaufgelöste Analyse und die Burst-Varianz-Analyse.

Die Verwendung mehrerer Fluorophore für smFRET-Experimente kann zu Komplexitäten im Versuchsdesign und bei der Herstellung von Proben von ausreichender Qualität führen. Die Verwendung einer einzigen Markierung und Fluoreszenzanisotropie löst einige dieser Komplexitäten.

Wir fanden heraus, dass sich die monomere Form der Forkhead-Domäne des menschlichen FoxP1 wie ein ungeordnetes Protein verhält und seine Faltungspopulation erhöht, wenn es dimerisiert.

[Dozent] Filtrieren Sie zunächst die vorbereitete Standard-Pufferlösung durch einen 0,22-Mikrometer-Porenfilter. Filtern Sie dann den Standardpuffer durch einen Aktivkohlefilter für die Einzelmolekülaufnahme. Für die Fluoreszenzsonden werden kleinvolumige Aliquots des vorbereiteten BODIPY Fluorescent Pro vorbereitet. Um den polarisationsaufgelösten Aufbau zu kalibrieren, schalten Sie zunächst die parallelen und senkrechten Detektorkanäle ein und schalten Sie den blauen Laser ein. Stellen Sie sicher, dass die Laserleistung auf 60 Mikrowatt eingestellt ist, und öffnen Sie das Bedienfeld für die zeitkorrelierte Einzelphotonenzählung oder die TCSPC-Software. Mischen Sie anschließend einen Mikroliter 100 nanomolare Rhodamin 110 mit 49 Mikrolitern destilliertem Wasser. Geben Sie einen Tropfen Immersionsflüssigkeit auf die Objektivlinse des Mikroskops. Setzen Sie das Deckglas auf das Mikroskopobjektiv und stellen Sie sicher, dass der Wassertropfen auf der Linse zentriert ist. Geben Sie 50 Mikroliter der verdünnten Rhodamin-110-Lösung in die Mitte des Deckglases für Kalibriermessungen. Stellen Sie die Bildebene so ein, dass sie sich innerhalb der Lösung und über der Glasoberfläche befindet. Suchen Sie mit dem Fokusknopf den zweiten hellen Fokuspunkt und stellen Sie ihn auf 1 1/2 Umdrehungen ein. Öffnen Sie nun die Software im Time-Tagged Time-Resolved-Modus und klicken Sie auf die Schaltfläche START. Zeichnen Sie die Zählrate 120 Sekunden lang auf. Für Hintergrundmessungen geben Sie 50 Mikroliter destilliertes Wasser in die Mitte des Deckglases und wiederholen Sie die Erfassung. Zeichnen Sie die Photonenzählrate 300 Sekunden lang auf und speichern Sie die Datei unter dem Namen water.ptu. Für zusätzliche Hintergrundmessungen geben Sie 50 Mikroliter Standardpuffer in die Mitte des Deckglases. Zeichnen Sie die Photonenzählrate 300 Sekunden lang auf und speichern Sie die Datei als standard_buffer.ptu. Starten Sie nun die Analysesoftware Burst Integration Fluorescence Lifetime, BIFL, und klicken Sie im automatischen Fenster auf Setup bestätigen. Klicken Sie anschließend auf "Parameter aus Datei abrufen" und dann auf "OK". Um die zu analysierende Messung auszuwählen, klicken Sie auf Data Path Array und wählen Sie den entsprechenden Datensatz aus. Laden Sie nun die Wassermessdatei water.ptu für Arrays, wie z. B. Green Scatter, die Datei standard_buffer.ptu für den grünen Hintergrund und Rhodamine110.ptu für Green thick. Klicken Sie unter den Auswahlparametern für einzelne Moleküle auf Weiter und dann auf Anpassen, um ein neues Popup-Fenster zu öffnen. Drücken Sie dann Schwellenwert, um die Interphotonen-Ankunftszeit zu ändern, und wählen Sie Einzelmolekül-Ereigniszeit für die mittlere Interphotonen-Ankunftszeit. Klicken Sie nun auf minimale Anzahl, um die minimale Anzahl von Photonen pro einzelnem Molekülereignis festzulegen. Schließen Sie dann das Popup-Fenster, indem Sie auf Return und OK klicken. Klicken Sie auf Color Fit-Parameter, um die anfängliche Fluoreszenzlebensdauer für Grün und andere Farben mithilfe von Fluoreszenzzerfallsparametern anzupassen. Ändern, Eingabeaufforderungen und Verzögern von Werten, indem Sie die Von- und Bis-Werte anpassen und das Popup-Fenster schließen. Drücken Sie abschließend auf Speichern, um die ASCII-Dateien zu verarbeiten und im ausgewählten Ordner zu speichern. Ein über Nacht verabreichtes Präinokulum von Escherichia coli C41 in 500 Milliliter LB-Medium mit zuvor zugesetztem Antibiotikum im Verdünnungsverhältnis 1:500 überführen. Messen Sie die Absorption der Kultur bei 600 Nanometern, um das Kulturwachstum zu überwachen. Wenn die optische Dichte zwischen 0,5 und 0,7 liegt, fügen Sie IPTG bis zu einer Endkonzentration von 0,5 Millimolar hinzu, um die Proteinexpression zu induzieren, und inkubieren Sie. Zentrifuugieren Sie die Bakterienzellen bei 3.000 g für 20 Minuten bei vier Grad Celsius, wenn die Kultur eine optische Dichte von 1,4 bis 1,6 erreicht. Lagern Sie das Pellet nach dem Entsorgen des Überstands bis zur Verwendung bei minus 20 Grad Celsius. Als nächstes fügen Sie 50 bis 100 mikromolare FoxP1-Proteine zu einem zehnfachen molaren Überschuss von DTT oder TCEP hinzu und inkubieren. Setzen Sie eine PD-10-Entsalzungssäule mit einem Säulenadapter für den Pufferwechsel in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen ein. Geben Sie fünf Milliliter PBS-Puffer zur Äquilibrierung in die Säule und zentrifugieren Sie ihn zwei Minuten lang bei 1.000 g. Übertragen Sie die PD-10-Säule in ein frisches 50-Milliliter-Röhrchen und geben Sie zwei Milliliter PBS-Puffer in die Säule. Laden Sie nun 500 Mikroliter FoxP1-Protein in die Säule. Eluieren Sie die Säule, indem Sie sie zwei Minuten lang bei 1.000 g zentrifugieren, um das gereinigte Protein zu sammeln. Übertragen Sie das Protein in einen Ultra-Zentrifugalfilter mit einem Molekulargewicht von 10 Kilodalton. Nach dem Zentrifugieren bei 7.500 g für 10 Minuten das konzentrierte Eluat auffangen. Messen Sie die Proteinkonzentration. Dann BODIPY zugeben und bei vier Grad Celsius zwei Stunden auf einem Rotator inkubieren. Wiederholen Sie den Pufferaustausch und die Proteinkonzentration. Messen Sie nach der Bestimmung der Proteinkonzentration den Grad der Markierung anhand der Formel. 495 Mikroliter Reinstwasser und fünf Mikroliter Tween 20 in eine Vertiefung eines Kammerobjektträgers geben und gut mischen. Nach einer 30-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur die Kammer zweimal vorsichtig mit Reinstwasser waschen und trocknen. Um die Hintergrundfluoreszenz zu korrigieren, führen Sie Messungen mit einer Pufferlösung durch. Kalibrieren Sie die relative Empfindlichkeit der parallelen und senkrechten Detektoren, indem Sie Daten von einem schnell rotierenden Farbstoff erfassen. Für Einzelmolekül-Fluoreszenz-Anisotropie-Experimente an monomerem FoxP1 fügen Sie 100 picomolares BODIPY-markiertes FoxP1 und 100 nanomolares unmarkiertes FoxP1 zu 500 Mikrolitern Standardpuffer in einem Kammerobjektträger hinzu. Beginnen Sie mit den Messungen und überprüfen Sie in der BIFL-Software, ob die Anzahl der innerhalb von 30 Sekunden aufgezeichneten Bursts zwischen 60 und 90 liegt. Wenn die Probe konzentrierter ist, verdünnen Sie sie, bis die Burst-Anzahl in diesen Bereich fällt. Analysieren Sie abschließend die Messungen. Die Einzelmolekül-Fluoreszenz-Anisotropie-Lebensdaueranalyse ergab eine Einfachverteilung, die aus zwei unterschiedlichen Rotationskorrelationszeiten in der FoxP1-DNA-Bindungsdomäne stammt, was auf die Koexistenz von geordneten und ungeordneten strukturellen Ensembles hindeutet. Die Burst-Varianz-Analyse identifizierte eine Untergruppe von FoxP1-Molekülen mit hoher Anisotropie und überschüssigen Varianten, was auf das Vorhandensein dynamischer Konformationsänderungen hindeutet. Die Photonenverteilungsanalyse unterschied zwischen monomeren und dimeren FoxP1-Zuständen und zeigte unterschiedliche Anisotropieverteilungen und Austauschraten. Die Dimerisierung beeinflusste lokale und globale Bewegungen in FoxP1, wobei Messungen der überschüssigen Varianz auf signifikante anisotrope Veränderungen an spezifischen Cystein-markierten Stellen hindeuteten. Die dynamische Anisotropieanalyse zeigte, dass FoxP1 bei Dimerisierung und DNA-Bindung eine partielle Entfaltung erfährt, wodurch sich der Anteil der strukturierten und ungeordneten Populationen verändert.