Name: Zeitaufgelöste Fluoreszenzanisotropie von einzelnen Molekülen zur Charakterisierung der lokalen Flexibilität in Biomolekülen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-25T13:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Erfahren Sie, wie zeitaufgelöste Fluoreszenzanisotropie die lokale Flexibilität und Dynamik von Biomolekülen auf Einzelmolekülebene charakterisiert. Diese Methode liefert Einblicke in Proteinverhalten wie bei FoxP1.

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<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher Scienctific</td><td>A20100</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A20100?SID=srch-srp-A20100</td></tr><tr><td>Amicon Ultra Zentrifugalfilter, 10 kDa MWCO</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC901008</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/mm/ufc9010</td></tr><tr><td>Ampicillin Natriumsalz</td><td>Millipore Sigma</td><td>A0166-5G</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/a0166</td></tr><tr><td>BODIP FL Maleimid (BODIPY FL N-(2-Aminoethyl))Maleimid)</td><td>ThermoFisher Scienctific</td><td>B10250</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B10250?SID=srch-srp-B10250</td></tr><tr><td>Einweg-PD 10 Entsalzungssäulen</td><td>Millipore Sigma</td><td>GE17-0851-01</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/ge17085101</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Millipore Sigma</td><td>10197777001</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/roche/dttro</td></tr><tr><td>DMSO, wasserfreies</td><td>ThermoFisher Scienctific</td><td>D12345</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/D12345?SID=srch-srp-D12345</td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Millipore Sigma</td><td>10104159001</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/roche/10104159001</td></tr><tr><td>E. coli C41-Bakterienzellen&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Foresigh Nuvi Ni-Charged IMAC, 5 mL Säule</td><td>Bio-Rad</td><td>12004037</td><td>https://www.bio-rad.com/en-us/sku/12004037-foresight-nuvia-ni-charged-imac-5-ml-column?ID=12004037</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millipore Sigma</td><td>7365-45-9</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/h3375</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Millipore Sigma</td><td>288-32-4</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/i5513</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Millipore Sigma</td><td>I6758-1G</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sial/i6758</td></tr><tr><td>MCE Membranfilter, 0,22 &mu; m Porengröße</td><td>Millipore Sigma</td><td>GSWP02500</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/mm/gswp02500</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>7647-14-5</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/s3014</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II Kammerschiebersystem</td><td>ThermoFisher Scienctific</td><td>154534</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/154534</td></tr><tr><td>OverExpress C41(DE3) chemisch Kompetente Zellen</td><td>Millipore Sigma</td><td>CMC0017-20X40UL</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/cmc0017</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Millipore Sigma</td><td>329-98-6</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/78830</td></tr><tr><td>Rhodamin 110</td><td>ThermoFisher Scienctific</td><td>419075000</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/419075000?SID=srch-hj-419075000</td></tr><tr><td>Natrium zweibasisches Phosphat</td><td>Millipore Sigma</td><td>7558-79-4</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/s3264</td></tr><tr><td>Monobasisches Natriumphosphat-Dihydrat</td><td>Millipore Sigma</td><td>13472-35-0</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/71505</td></tr><tr><td>TCEP, Hydrochlorid, Reagenzqualität</td><td>Millipore Sigma</td><td>580567-5GM</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/mm/580567</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Millipore Sigma</td><td>11332465001</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/roche/11332465001</td></tr></tbody></table>

zeitaufgelöste fluoreszenzanisotropie von einzelnen molekülen zur charakterisierung der lokalen flexibilität in biomolekülen

Time-Resolved Fluorescence Anisotropy from Single Molecules for Characterizing Local Flexibility in Biomolecules

Die Fluoreszenzanisotropie ergibt sich aus der relativen Ausrichtung der Absorption des Fluorophors und der Emissionsdipolmomente. Wenn Fluorophore polarisiertem Licht ausgesetzt werden, werden Fluorophore mit Absorptionsübergangsmomenten, die auf den elektrischen Feldvektor des einfallenden Lichts ausgerichtet sind, bevorzugt angeregt (Photoselektion). Folglich wird die Population des angeregten Zustands teilweise orientiert, wobei die Übergangsmomente eines signifikanten Teils der angeregten Moleküle mit dem elektrischen Feldvektor des polarisierten aufregenden Lichts61 ausgerichtet sind. Fluorophore rotieren aufgrund ihrer Brownschen Bewegung. Somit dreht sich auch das Emissionsübergangsmoment, was zu einer Zeitabhängigkeit von der Fluoreszenzanisotropie führt. Dieser Effekt kann genutzt werden, um die Rotationsbewegungen fluoreszierender Moleküle zu messen, Bindungsereignisse zu erkennen, die Umgebung des Fluorophors zu charakterisieren und die Molekulardynamik zu erfassen.
Einzelmolekülexperimente sind einzigartig positioniert, um die Heterogenität der Probe zu bestimmen. Durch die Nutzung der Einzelmolekülempfindlichkeit und der Fluoreszenzanisotropie wird die Multiparameter-Fluoreszenzspektroskopie um eine weitere Dimensionalität erweitert. In einem typischen konfokalen Einzelmolekülmikroskop (Abbildung 2)20,21 kann die Fluoreszenzanisotropie durch den Einsatz von gepulsten Lasern intensitätsbasiert oder zeitaufgelöst bestimmt werden.
Um die depolarisierenden Effekte des Objektivs mit hoher numerischer Apertur in einem Konfokalmikroskop62 zu betrachten, ist die richtige Form der zeitaufgelösten Anisotropie35, 63 gegeben durch
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq01.jpg" style="margin: auto;">(1)
wobei <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq02.jpg" style="margin: auto;"> und <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq03.jpg" style="margin: auto;"> die zeitaufgelöste Fluoreszenzintensität im y-ten Detektionskanal nach Anregung bei der Wellenlänge X für die parallele und senkrechte Polarisation L1 und L2 sind und Faktoren sind, die die Mischung zwischen den parallelen und senkrechten Signalen aufgrund des bei diesen Messungen verwendeten Objektivs mit hoher numerischer Apertur (NA) beschreiben35,62, 64. Urheberrecht Unterschiede in der Detektionseffizienz des parallelen <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq04.jpg" style="margin: auto;">und senkrechten Detektionskanals <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq05.jpg" style="margin: auto;">für den Farbstoff werden mit dem Verhältnis der Detektionseffizienzen korrigiert. <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq06.jpg" style="margin: auto;"> Der G-UV wird auch als G-Faktor bezeichnet.
Die zeitaufgelöste Fluoreszenzanisotropie kann mit Hilfe eines multiexponentiellen Zerfalls modelliert werden, um zu erklären, dass das Fluorophor an ein größeres Biomolekül gebunden ist
<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq07.jpg" style="margin: auto;">,     (2)
wobei R0 die Fluorophor-abhängige fundamentale Anisotropie ist (typischerweise R0 = 0,38), R∞ die Restanisotropie ist und ρ1 und ρ2 schnelle (lokale Bewegungen des Fluorophors) bzw. langsame (globale Bewegung des Makromoleküls) Rotationskorrelationszeiten sind.
Bei Einzelmolekül-Anisotropiemessungen (Abbildung 2) werden Photonenankunftszeiten aufgezeichnet, um einzelne Emitter mit Hilfe der burst-integrierten Fluoreszenzlebensdaueranalyse (BIFL) zu identifizieren33,35. Die Ankunftszeiten zwischen den Photonen (Δt) werden anhand eines gleitenden Durchschnitts geglättet und dann zur besseren Visualisierung grafisch dargestellt. Das Histogramm dieser Zeiten ist mit einem halben Gauß versehen, um den Mittelwert und die Standardabweichung der Photonen zu bestimmen, die aus dem Hintergrund stammen. Ein willkürlicher Schwellenwert, der auf ein Vielfaches der Standardabweichung festgelegt ist, wird verwendet, um einzelne Ereignisse herauszufiltern und gleichzeitig das erste und letzte Photon in jedem Ausbruch zu identifizieren. Photonen in jedem Burst werden dann für die weitere Analyse integriert, die die Berechnung der zeitaufgelösten und intensitätsbasierten Fluoreszenzanisotropie im stationären Zustand unter Verwendung der Gleichungen 1 und 2 oder über einen Maximum-Likelihood-Schätzer35 umfasst. Aufgrund der begrenzten Anzahl von Photonen in Einzelmolekülereignissen berücksichtigt der Maximum-Likelihood-Schätzer nur eine einzige exponentielle Komponente und wird nicht weiter diskutiert.
In einem zweidimensionalen Histogramm von Einzelmolekülereignissen können die mittlere Fluoreszenzlebensdauer (τ) und die Anisotropie (rxy) durch die Perrin-Gleichung29,61 in Beziehung gesetzt werden, um (ρ) als mittlere Rotationszeit zu erhalten.
<img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq08.jpg" style="margin: auto;">(3)
Spezifische ρ-Werte können mit höherer Sicherheit durch eine "Sub-Ensemble"-Analyse (se) erhalten werden, bei der die Photonen verschiedener Bursts in einen kombinierten zeitaufgelösten Fluoreszenz-Anisotropie-Zerfall integriert werden, der durch Optimierung der Parameter von Gleichung 2 zum experimentellen Zerfall (seTRFA) analysiert werden kann. Zeitaufgelöste Anisotropie kann die Heterogenität und Dynamik auflösen, die mit Rotationsbewegungen (lokal und global) der Biomoleküle innerhalb der Fluoreszenzemission verbunden sind, die innerhalb des ns-Zeitrahmens auftritt.
Um die Dynamik innerhalb einzelner Molekülereignisse (auf der Submillisekundenskala) zu detektieren, haben wir die zeitaufgelöste Anisotropie-Burst-Varianz-Analyse (traBVA)57 eingeführt. In traBVA beträgt für einen Photonenausbruch, der Mi aufeinanderfolgende Photonensegmente enthält, die überschüssige Anisotropievarianz (s2) für Ausbrüche
<img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq09.jpg" style="margin: auto;">.     (4)
Für einen einzelnen anisotropen Zustand ergibt sich die Varianz σ2 ausschließlich aus dem Schrotrauschen65 (sn: √N, wobei N die Anzahl der Photonen ist)
<img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq10.jpg" style="margin: auto;">(5)
Dabei ist m die Anzahl der Photonen in einem Ausbruch. Um eine zusätzliche Varianz in der Anisotropie zu identifizieren, können wir daher die überschüssige Anisotropievarianz (S2) aufgrund der Konformationsheterogenität als Differenz zwischen den Gleichungen 4 und 5 definieren.
<img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq11.jpg" style="margin: auto;">(6)
Um die Dynamik, die bei der Beobachtung einzelner Moleküle auftritt, zu erfassen und die Varianzapproximation zu berücksichtigen, kann die dynamische Anisotropie-Photonenverteilungsanalyse (daPDA)55,56 verwendet werden. In der daPDA wird die Fluoreszenzintensität modelliert, indem einer bedingten Wahrscheinlichkeit (<img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq12.jpg" style="margin: auto;">) gefolgt wird, die als Binomialverteilung ausgedrückt wird.
<img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq13.jpg" style="margin: auto;">(7)
Zusammen mit einer Schätzung der Hintergrundzählrate, die einer Poisson-Verteilung folgt
<img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq14.jpg" style="margin: auto;">(8)
wobei <img alt="Equation 15" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq15.jpg" style="margin: auto;"> die durchschnittliche Anzahl der Hintergrundphotonen pro eingestelltem Zeitfenster ist. Die parallelen und senkrechten Hintergrundzählungen <img alt="Equation 16" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq16.jpg" style="margin: auto;"> und <img alt="Equation 17" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq17.jpg" style="margin: auto;">können anhand von Pufferproben als Referenz gemessen werden. Die experimentell ermittelte Fluoreszenzanisotropie wird durch Minimierung einer Gütezahl χ2 mit einer Fluoreszenzintensitätsverteilung pro Polarisationskanal optimiert, die kinetische Änderungen einschließen kann.
Die bereitgestellten Analyseroutinen und Datenrepräsentationen bieten einen umfassenden Ansatz zur Interpretation der gesammelten Daten. Obwohl sich dieses Protokoll in erster Linie auf konfokale Messungen konzentriert, die bei der Erfassung von Anisotropieänderungen von Nanosekunden bis Millisekunden begrenzt sind, ist es möglich, ein Totalreflexionsmikroskop einzusetzen, um die Fluoreszenzanisotropie über längere Zeitskalen zu überwachen, was eine Zeitreihenanalyse ermöglicht66. Für konfokale Einzelmolekülmessungen heben wir die Verwendung von mehrdimensionalen Histogrammen hervor, die einen einzigartigen Fingerabdruck des beobachteten Ensembles erstellen. Zeitaufgelöste Fluoreszenzzerfälle, die aus ausgewählten Populationen rekonstruiert werden, können die Entwicklung der Fluoreszenzanisotropie auf der Nanosekundenskala verfolgen (Abbildung 3). Die Photonenverteilungsanalyse55,56 und die Burst-Varianz-Analyse (BVA)57,58 können auch die Dynamik auf mittleren Zeitskalen zwischen zeitaufgelösten Zerfällen und mehrdimensionalen Histogrammen erfassen. Obwohl dieses Protokoll die Verwendung der Polarisationsfluoreszenz-Korrelationsspektroskopie (FCS) mit oder ohne gepulste Anregung67,68, die die Zeitskalen von Nanosekunden bis Millisekunden überbrücken kann, nicht abdeckt, können dieselben Daten zur Berechnung von FCS69 verwendet werden, obwohl dies außerhalb des Rahmens des vorgestellten Protokolls liegt. Wenn solche Versuche durchgeführt werden, wird eine längere Zeit für die Probenmessung empfohlen.
Dieser Ansatz wurde auf ein komplexes System wie die menschlichen FoxP-Proteine angewendet und liefert wertvolle Einblicke in die Bewegungen, die an ihrem Wirkmechanismus beteiligt sind. FoxP-Proteine sind Transkriptionsfaktoren, die an verschiedenen physiologischen Aspekten wie der Entwicklung von Gehirn und Lunge beteiligt sind. Wichtig ist, dass verschiedene Mutationen erkannt wurden, die die Funktion dieser Proteine beeinträchtigen 70,71. Unter Verwendung der DNA-Bindungsdomäne von FoxP1 als Modell erzeugten wir verschiedene Einzelcystein-Mutanten, um einen BODIPY-FL-Farbstoff als Tracker für Bewegungen einzuführen (Abbildung 4A). Tatsächlich haben wir den Effekt der Dimerisierung und der DNA-Bindung als wichtige strukturelle Regulatoren dieses Proteins untersucht. Mit dem smFA-Ansatz generierten wir 2D-smFA-Plots und stellten traBVA und daPDA für jede Mutante unter monomeren und dimeren Bedingungen her. Wir zeigen ein Beispiel für eine der untersuchten Einzelmutanten (Abbildung 4). Das Anisotropieverhalten ist bei allen Mutanten ähnlich, was die Bestimmung von hohen und niedrigen Rotationskorrelationszeiten und damit von vermuteten, ungeordneten und gefalteten Ensembles betrifft. Dennoch ist es in allen Mutanten sehr heterogen in Bezug auf die Fraktion und Kinetik jedes Ensembles, was unterschiedliche Änderungen des Übergangs von Ordnung zu Unordnung zeigt, die durch die Dimerisierung und die DNA-Bindung beeinflusst werden, und zeigt die Beschreibung der strukturellen Dynamik entlang der Kette mit hoher Auflösung (Abbildung 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67802/67802fig01.jpg"> 
Abbildung 1: Dynamischer Bereich von Biomolekülen und Fluoreszenzanisotropiemethoden. (A) Die Anisotropie kleiner Fluorophore, die an verschiedenen Positionen entlang des Rückgrats des interessierenden Biomoleküls gebunden sind, informiert über die lokale Strukturdynamik. (B) Zeitskalen, die durch Fluoreszenzintensitätszerfälle (zeitaufgelöste Fluoreszenzanisotropie, FA) und Einzelmolekül-Histogramme von konfokalen Einzelmolekülmikroskopdaten untersucht werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67802/67802fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67802/67802fig02.jpg"> 
Abbildung 2: Registrierung und Verarbeitung von Einzelmolekül-Fluoreszenz-Anisotropie-Daten. (A) Frei diffundierende Moleküle werden mit einem konfokalen Einzelmolekülmikroskop analysiert, das mit einem einzelnen linear polarisierten Anregungslaser (in unserem Fall blau) ausgestattet ist. Die Fluoreszenzemission (in unserem Fall grün) wird von zwei Detektoren detektiert, nachdem ein Strahlpolarisator das Signal in zwei Polarisationen (parallel <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq18.jpg" style="margin: auto;">und senkrecht <img alt="Equation 19" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq19.jpg" style="margin: auto;">zur Anregungsquelle) aufgeteilt hat. (B) Jedes detektierte Photon wird durch drei Parameter charakterisiert: Mikrozeit, Makrozeit und Kanaltyp. Die Daten werden im TTTR-Format (Time-Tagged Time-Resolved)72 gespeichert. (C) Bursts einzelner Moleküle werden ausgewählt und verarbeitet, um Fluoreszenzparameter, einschließlich der Fluoreszenzanisotropie, für jedes beobachtete Molekül zu extrahieren. (D) Die Daten werden auf verschiedene Weise dargestellt, einschließlich zweidimensionaler Diagramme der Fluoreszenzanisotropie im Vergleich zur Fluoreszenzlebensdauer und zeitaufgelöster Anisotropiezerfälle. Diese Darstellungen ermöglichen sowohl die visuelle als auch die quantitative Bestimmung der Fluoreszenzlebensdauer, der Rotationskorrelationszeiten und der Systemheterogenität. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67802/67802fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67802/67802fig03.jpg"> 
Abbildung 3: Repräsentative Daten für das FoxP1-Domain-Swapped-Dimer. (A) Korrelation der Fluoreszenzanisotropie (r-Streuung) mit der mittleren Fluoreszenzlebensdauer pro Molekül als Konturdiagramm. Überlagerung einer einzelnen Perrin-Gleichung für zwei Rotationskomponenten als Repräsentant des Ensemble-Mittelwerts des Moleküls unter Berücksichtigung von ρ1 und ρ2 von 0,2 ns bzw. 8,5 ns. (B) Zeitaufgelöste Fluoreszenzzerfälle unter dem Ensemble werden verwendet, um die zeitaufgelöste Fluoreszenzanisotropie der Probe zu berechnen. Die Anpassung an Gleichung 2 löste die lokalen und globalen Komponenten der Fluoreszenzanisotropie auf. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67802/67802fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67802/67802fig04.jpg"> 
Abbildung 4: FoxP1-Dynamik im Sub-Millisekunden-Bereich, überwacht mit Hilfe der Einzelmolekül-Fluoreszenzanisotropie (smFA). (A) Eine Cartoon-Darstellung der monomeren FoxP1-Struktur. (B) Ein zweidimensionales Histogramm veranschaulicht die dynamische Heterogenität und zeigt zwei unterschiedliche Rotationskorrelationszeiten, die durch zeitaufgelöste Fluoreszenzanisotropie identifiziert wurden. Die zeitaufgelöste Anisotropie-Burst-Varianz-Analyse (traBVA) deckt eine kleine Teilmenge von Ereignissen mit übermäßiger Varianz (Gl. 6) auf, die eine große Anisotropie aufweisen. Die quantitative dynamische Anisotropieanalyse mit Hilfe der Photonenverteilungsanalyse (PDA) extrahiert die Austauschraten für diesen Prozess weiter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67802/67802fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67802/67802fig05.jpg"> 
Abbildung 5: Screening der lokalen und globalen Bewegungen von FoxP1 während der Dimerisierung. (A) Eine Cartoon-Darstellung vergleicht das monomere FoxP1 mit seiner dimeren Form. (B) Die mittlere überschüssige Varianz pro Standort unter monomeren und dimeren Bedingungen wird gezeigt, wobei eine größere übermäßige Varianz auf signifikantere Änderungen der Anisotropie hinweist. (C) Die dynamische Anisotropieanalyse mit Hilfe der Photonenverteilungsanalyse (PDA) hilft bei der Bestimmung von Populationsfraktionen (hohe Anisotropie in dunklen Farben und niedrige Anisotropie in heller Farbe) in Abwesenheit (grün) und Vorhandensein (gelb) von DNA. In diesem Ansatz wurden Raten (nicht gezeigt) für Übergänge zwischen lokalem und globalem Verhalten geschätzt, was zeigt, dass FoxP1 eine partielle Entfaltung durchläuft. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67802/67802fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Zeitaufgelöste Fluoreszenzanisotropie von einzelnen Molekülen zur Charakterisierung der lokalen Flexibilität in Biomolekülen

We describe a protocol for conducting time-resolved fluorescence anisotropy at the single-molecule level using confocal microscopy to investigate the ...

time-resolved-fluorescence-anisotropy-from-single-molecules-for

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

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