Feineinstellung der Orientierung von Caenorhabditis elegans auf kanalisierten Agar-Pads für die Bildgebung der Neuroregeneration

Das Hauptaugenmerk unseres Labors liegt auf der Definition der Mechanismen, die der Regeneration des Zentralnervensystems von Säugetieren zugrunde liegen, anhand des Modellorganismus C. elegans. Wir untersuchen die Regeneration über mehrere Neuronen hinweg und suchen nach der Identität des Präkonditionierungssignals, das zu einer verstärkten Regeneration des Zentralnervensystems führt. Zu den aktuellen experimentellen Herausforderungen gehört das Einbringen von Luftblasen beim Austausch der Glasplatte auf der Schallplatte und das Erreichen einer gleichmäßigen Formdicke.

Sobald die PDMS-Form jedoch erstellt ist, kann sie für Backen wiederverwendet werden. Die Forschungslücke, die wir schließen, ist die begrenzte Kontrolle über die Orientierung erwachsener Tiere. Erwachsene Tiere haben einen größeren Durchmesser und sind stärker pigmentiert, was zu Problemen bei der Bildgebung in tieferen Z-Ebenen führt.

Zusätzlich verändert das Einbringen des Deckglases auch die anfängliche Ausrichtung. Die Kanäle tragen dazu bei, die Ausrichtung der Tiere beim Einbringen des Deckglases beizubehalten, so dass die Zielzellen näher am Objektiv für die Bildgebung sein können. Die Kanäle reduzieren auch den Stress für Tiere, fördern die normale Physiologie, fördern die lineare Tierkonfiguration und schaffen Konsistenz bei der Bildgebung bei mehreren Tieren.

Gießen Sie zunächst ein Verhältnis von eins zu 10 des Schnellhärtungsmittels zur Basis in eine Einweg-Wiegeschale. Mischen Sie die ungehärtete Flüssigkeit 45 Sekunden lang gründlich, bis sie vollständig integriert und voller Blasen ist. Stellen Sie dann das Tablett mit dem nicht ausgehärteten PDMS-Gemisch schräg in einen Vakuumexsikkator.

Wechseln Sie den Druck dreimal zwischen minus 0,09 Kilo Pascal und minus 0,1 Kilo Pascal, damit Luftblasen an die Oberfläche kommen können. Spülen Sie die Schallplatte und die Glasplatte gründlich mit entionisiertem Wasser ab und lassen Sie die Schallplatte vor der weiteren Verwendung vollständig an der Luft trocknen. Legen Sie ein Blatt Aluminiumfolie auf die Heizplatte, um überschüssiges PDMS aufzufangen.

Platzieren Sie dann an jedem Ende der Schallplatte einen Objektträger, um die Formdicke einzustellen und eine gleichmäßige Höhe beim Drücken der Glasscheibe auf das nicht ausgehärtete PDMS zu gewährleisten. Gießen Sie nun die nicht ausgehärtete PDMS-Flüssigkeit auf eine Seite der Schallplatte. Kippen Sie die Glasplatte und bringen Sie sie langsam nach unten, damit die eingeschlossene Luft entweichen kann.

Anschließend härten Sie das PDMS bei 100 Grad Celsius für 20 Minuten aus. Nehmen Sie die Schallplatte von der Herdplatte und lassen Sie sie abkühlen. Ziehen Sie danach PDMS vorsichtig von der Schallplatte ab, um ein Reißen zu vermeiden.

Ziehen Sie dann das PDMS von der Glasscheibe ab. Schneiden Sie das PDMS mit einem scharfen Rasiermesser mit einem scharfen Rasiermesser ab, um eine kanalisierte Agarform zu erzeugen. Schälen Sie das überschüssige PDMS, um die fertig geschnittene kanalisierte Agarform zu zeigen.

0,6 Gramm Agar und 30 Milliliter flüssige Brühe des Nematodenwachstumsmediums in einen Kolben geben. Legen Sie einen Rührstab in die Flasche und erhitzen Sie die Mischung auf einer heißen Platte, die auf 120 Grad Celsius eingestellt ist. Fügen Sie 120 Mikroliter Natriumazid-Stammlösung hinzu, nachdem das Gel geschmolzen ist.

Waschen Sie dann die PDMS-Form gründlich mit Wasser und lassen Sie sie an der Luft trocknen. Platzieren Sie die PDMS-Form zwischen zwei Sätzen von Schieberpaaren, um sie für die Verwendung vorzubereiten. Ziehen Sie die Agarlösung mit einer Pipette auf und ab, um die Pipettenspitze zu erwärmen, und pipettieren Sie 300 Mikroliter geschmolzenen Agar auf die PDMS-Form.

Legen Sie abschließend einen Objektträger direkt auf den Agar und stellen Sie sicher, dass er an den Seiten auf den Objektträgern aufliegt. Entfernen Sie den Objektträger, nachdem der Agar vollständig abgekühlt ist. Kanalisierte Agar-Pads erleichterten die genaue Ausrichtung von Caenorhabditis elegans, indem sie das Tier so rollten, dass es Orientierungspunkte wie die Vulva und den S-förmigen Darm ausrichtete, die unter einem Fluoreszenz-Präpariermikroskop überprüft wurden, bevor sie auf ein inverses Mikroskop übertragen wurden.

Die Fluoreszenzbildgebung bestätigte die korrekte Orientierung von Caenorhabditis elegans auf den kanalisierten Agarpads, wie in fluoreszierenden Mikroaufnahmen zu sehen ist. Kanalisierte Agar-Pads verbesserten die Bildqualität für die neuronale Regeneration, indem sie regenerierte Neuronenfasern näher an der Objektivlinse positionierten und so Lichtstreuung und -absorption minimierten.