Name: Feineinstellung der Orientierung von Caenorhabditis elegans auf kanalisierten Agar-Pads für die Bildgebung der Neuroregeneration (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-31T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: Lernen Sie die Feinabstimmung der Orientierung von Caenorhabditis elegans auf kanalisierten Agar-Pads mit PDMS-Formen aus Schallplatten. Diese Methode verbessert die Bildgebung neuronaler Strukturen bei der Neuroregeneration erheblich.

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<meta charset="utf8"></head><body>Herstellung von kanalisierten Agar-Pads unter Verwendung von PDMS-Formen zur Kontrolle der Tierorientierung

<ol><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li>
<li>Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+killing+of+cells+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biol. 48, 225-250 (1995).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+self-regulating+feed-forward+circuit+controlling+C-elegans+egg-laying+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">A self-regulating feed-forward circuit controlling C-elegans egg-laying behavior.</a> Curr Biol. 18 (19), 1445-1455 (2008).</li>
<li>Chung, S. H., Mazur, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtosecond+laser+ablation+of+neurons+in+C.+elegans+for+behavioral+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Phys+A-Mater+Sci+Process%22%5BJournal%5D)">Femtosecond laser ablation of neurons in C. elegans for behavioral studies.</a> Appl Phys A-Mater Sci Process. 96 (2), 335-341 (2009).</li>
<li>Zellag, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CentTracker%3A+a+trainable%2C+machine-learning-based+tool+for+large-scale+analyses+of+Caenorhabditis+elegans+germline+stem+cell+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">CentTracker: a trainable, machine-learning-based tool for large-scale analyses of Caenorhabditis elegans germline stem cell mitosis.</a> Mol Biol Cell. 32 (9), 915-930 (2021).</li>
<li>Huang, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+neuron+in+C.+elegans+orchestrates+multiple+motor+outputs+through+parallel+modes+of+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">A single neuron in C. elegans orchestrates multiple motor outputs through parallel modes of transmission.</a> Curr Biol. 33 (20), 4430-4445.e6 (2023).</li>
<li>Rasmussen, N. R., Dickinson, D. J., Reiner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ras-dependent+cell+fate+decisions+are+reinforced+by+the+RAP-1+small+GTPase+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Ras-dependent cell fate decisions are reinforced by the RAP-1 small GTPase in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 210 (4), 1339-1354 (2018).</li>
<li>Rivera Gomez, K., Schvarzstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+nematodes+for+live+imaging+using+an+agarose+pad+produced+with+a+vinyl+record%5BTitle%5D)+AND+%22MicroPubl+Biol%22%5BJournal%5D)">Immobilization of nematodes for live imaging using an agarose pad produced with a vinyl record.</a> MicroPubl Biol. 2018, (2018).</li>
<li>Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+AFD+neuron+in+C.+elegans+thermotaxis+analyzed+using+femtosecond+laser+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation.</a> BMC Neuroscience. 7 (1), 30(2006).</li>
<li>Gerhold Abigail, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+the+regulation+of+stem+and+progenitor+cell+mitotic+progression+by+in+situ+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Investigating the regulation of stem and progenitor cell mitotic progression by in situ imaging.</a> Curr Biol. 25 (9), 1123-1134 (2015).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>125 mL Erlenmeyerkolben</td><td>Corning</td><td>4980-125</td><td></td></tr><tr><td>33 1/2 RPM oder 12 Zoll Langspielplatte (LP) Schallplatte&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Tiefe des einzelnen Kanals: 50 & Mikro; m, Breite: 200 &micro; m</td></tr><tr><td>30 mL Kunststoffspritze</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-793-817</td><td></td></tr><tr><td>90% Platin, 10% Iridium Draht</td><td>Tritech Research&nbsp;</td><td>PT-9010</td><td>wird zur Herstellung von Platin-Pick-Aluminiumfolie verwendet</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Amazon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAL131910B</td><td></td></tr><tr><td>Glasscheibe</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>7 Zoll x 5 Zoll Glasscheibe aus dem Rahmen&nbsp;</td></tr><tr><td>Glaspipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td>zur Herstellung einer Platin-Pick-Heizplatte</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>SP88857104</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA3333736</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger&nbsp;</td><td>Mckesson</td><td>938360</td><td></td></tr><tr><td>Agar in molekularbiologischer Qualität</td><td>Benchmark Scientific</td><td>A1705</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat zweibasisch&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P290-500</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat monobasisch&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Fisher</td><td>Scientific AAJ2161022</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>quadratisches Deckglas</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541-016</td><td></td></tr><tr><td>SYLCAP 284-F (Fast Cure) Silikonelastomer-Verkapselungskit, transparent, optisch klar, 10:1 Mix, 500 gm/ml (0,5 kg), schneller als Sylgard 184 und ähnliche&nbsp;</td><td>MicroLubrol</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Vakuum-Exsikkator&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-648-100</td><td></td></tr><tr><td>Wiegeschale&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-549-750</td><td></td></tr></tbody></table>

feineinstellung der orientierung von caenorhabditis elegans auf kanalisierten agar-pads für die bildgebung der neuroregeneration

Fine Adjustment of Caenorhabditis elegans Orientation on Channeled Agar Pads for Imaging Neuroregeneration

Herstellung von PDMS-Formen Durch das Zyklieren des Vakuumdrucks während der Formherstellung werden Luftblasen aus dem nicht ausgehärteten PDMS durchstochen und entfernt, wodurch eine blasenfreie Form gewährleistet wird. Wie in Abbildung 3D gezeigt, steigen Blasen an die Oberfläche und stechen ein. Blasenfreie Formen können saubere Kanäle erzeugen.
Verfestigung der PDMS-Form Wenn Sie die Glasscheibe auf die Schallplatte aufsetzen, vermeiden Sie Luftspalte. Diese Lücken können zu ungleichmäßiger Dicke oder Oberflächenfehlern führen. Blasen, falls vorhanden, können visuell erkannt werden. Durch das Drücken der Glasscheibe von einer Seite auf die andere wird Luft verdrängt, wodurch die Blasenbildung minimiert und eine gleichmäßige Formdicke gewährleistet wird, wie in Abbildung 4A gezeigt.
Verwendung von kanalisierten Agar-Pads zur Feinorientierung von C. elegans Die kanalisierten Agar-Pads ermöglichen eine präzise Orientierung von C. elegans. Wir stellen die Ausrichtung des Tieres ein, indem wir das Tier leicht mit einem Platindrahtpickel rollen, während wir die Ausrichtung anhand von Orientierungspunkten wie der Vulva oder dem S-förmigen Darm überprüfen (Abbildung 5A, C). Wir bestätigen die Orientierung unter einem Fluoreszenzpräpariermikroskop, bevor wir die Tiere in ein inverses Mikroskop übertragen, das in Abbildung 5B,D gezeigt ist.
Beurteilung der Regeneration von Neuronenfasern mit kanalisierten Agar-Pads Kanalisierte Agar-Pads verbessern die Bildqualität der neuronalen Regeneration, indem sie das Tier optimal ausrichten. Die Positionierung regenerierter Neuronenfasern näher an der Objektivlinse reduziert die Lichtstreuung und -absorption und verbessert die Bildschärfe. Abbildung 5E,F zeigt, dass die Platzierung der Regenerationsstelle näher am Objektiv die Bildgebungsqualität verbessert und eine genauere Analyse des neuronalen Nachwachsens ermöglicht.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67811/67811fig01.jpg"> 
Abbildung 1: Caenorhabditis elegans auf flachen und kanalisierten Ballen. (A) Tier auf flachem Agar-Pad in DV-Ausrichtung; Vulva-Gesichter, Deckglas. (B) Das Einbringen des Deckglases drückt die Vulva zur Seite und zwingt das Tier in die seitliche Ausrichtung. (C) Tier auf kanalisiertem Agarpad in DV-Ausrichtung. (D) Tierreste in DV-Ausrichtung nach dem Einbringen des Deckglases. (E) Hellfeldbild einer Rollenmutante auf einem kanalisierten Agarpad in DV-Ausrichtung. (F) Hellfeldbild mit Deckglas, gleiches Tier wie E bleibt in DV-Ausrichtung. Abkürzungen: DV = dorsal-ventral; lat = lateral. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67811/67811fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67811/67811fig02.jpg"> 
Abbildung 2: Materialien und Ausrüstung für die PDMS-Herstellung. (A) SYLCAP 284-F Silikonelastomer-Kit. (b) Skala. (C) Spritze aus Kunststoff. (D) Vakuum-Exsikkator. (E) Heizplatte. (F) 12-Zoll-Langspiel-Schallplatte, bei Bedarf auseinanderbrechen. (G) Glasscheibe. Abkürzung: PDMS = Polydimethylsiloxan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67811/67811fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67811/67811fig03.jpg"> 
Abbildung 3: Mischen und Vakuumieren von nicht ausgehärtetem PDMS. (A) Mischen Sie die Basis und das Härtungsmittel in der Schale. (B) Stellen Sie das Tablett in eine Vakuumkammer. (C) Zyklus des Vakuums dreimal, damit die Blasen an die Oberfläche gelangen können. (D) Nach einer Stunde platzten die meisten Blasen. Hinweis: Verbesserte Übertragung durch PDMS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67811/67811fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67811/67811fig04.jpg"> 
Abbildung 4: Einbringen einer Glasscheibe in ein nicht ausgehärtetes PDMS ohne Blasen. (A) Einführung einer Glasscheibe auf einer Schallplatte ohne Blasen. (B) Erstarrte PDMS-Form, die aus der Akte entfernt wurde, mit eingelassenen Detaillierungskanälen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67811/67811fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67811/67811fig05.jpg"> 
Abbildung 5: Hellfeld- und Fluoreszenzbilder von C. elegans , die auf gechanneltem Agar montiert sind. (A) Hellfeldbild eines Tieres in bilateraler DV-Orientierung. Anatomischer Orientierungspunkt für die DV-Orientierung: spiralförmiger S-förmiger Darm (dunkleres Gewebe durch Pfeil gekennzeichnet), der die Mittellinie ~60% des Abstands von der Nase bis zum Schwanz kreuzt. (B) Fluoreszenzbild von Neuronen in DV-Orientierung, gleiches Tier wie A. (C) Hellfeldbild eines Tieres in Lat-Ausrichtung. Anatomischer Orientierungspunkt für die Latzugausrichtung: Vulva zur Seite. (D) Fluoreszenzbild von Neuronen in Lat-Orientierung, gleiches Tier wie C. (E) Orientierung mit Regeneration (Pfeil) in tieferen (fernen) Seiten eines Tieres. (F) Orientierung mit Regeneration bei Tieren mit flacherer Seite, die näher am Ziel liegen; Regeneration klarer (Pfeil). Maßstabsleisten = 20 μm. Abkürzungen: DV = dorsal-ventral; lat = lateral. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67811/67811fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Feineinstellung der Orientierung von Caenorhabditis elegans auf kanalisierten Agar-Pads für die Bildgebung der Neuroregeneration

Caenorhabditis elegans is a model organism widely used for studying biological processes. Its transparency and small size make it ideal for imaging ...

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Feineinstellung der Orientierung von Caenorhabditis elegans auf kanalisierten Agar-Pads für die Bildgebung der Neuroregeneration (Video) | JoVE Journal

Feineinstellung der Orientierung von Caenorhabditis elegans auf kanalisierten Agar-Pads für die Bildgebung der Neuroregeneration

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