Hitzetoleranz-Assays mit dem Drosophila Activity Monitor System: Ein Leitfaden für eine ausführbare Anwendung zur Datenanalyse

Während des Studiums begann ich mich sehr für Hitzetoleranz zu interessieren, insbesondere für ihre Verhaltenskomponenten, und seitdem interessiere ich mich sehr für die Verhaltensthermoregulation und die Mechanismen, die Endotherme einsetzen, um ihre Körpertemperatur zu regulieren. Die Hitzetoleranz wird seit Jahrzehnten durch die Beobachtung von Organismen durch Forscher untersucht. In jüngerer Zeit sind videobasierte und automatisierte Methoden zur Messung von Aspekten der Hitzetoleranz auf dem Vormarsch.

Und ich denke, dass es wirklich cool sein wird zu sehen, wohin uns diese neuen Technologien führen werden, wenn es darum geht, einige der Feinheiten des Verhaltens und der Aktivität in Bezug auf die Wärmeregulierung zu erforschen. Eine der Herausforderungen in diesem Bereich besteht darin, dass, obwohl wir jetzt eine Möglichkeit haben, große Mengen an Aktivitätsdaten zu überwachen und zu sammeln, die Interpretation dessen, was die Aktivitätsdaten in Bezug auf ihre biologische Relevanz für reale Anwendungen bedeuten, eine Frage bleibt, die weiterer Forschung bedarf. Einer der Vorteile des automatisierten Programms besteht darin, dass Sie mit großen Datensätzen viel leichter zugänglich umgehen können.

Früher musste man große Excel-Dateien manuell durchgehen, um die Ergebnisse zu analysieren und zu interpretieren. Das automatisierte Programm erleichtert die Datenanalyse erheblich. Laden Sie zunächst die Fliegen in die DAM2-Monitorröhren und verschließen Sie beide Enden der Röhren mit Watte.

Aspirieren Sie einzelne Fliegen aus den Auffangfläschchen in die Monitorröhrchen. Setzen Sie die Analyseröhrchen in die Aktivitätsmonitore ein und dokumentieren Sie sorgfältig die Schlitznummern für jede Gruppe. Legen Sie die Monitore in den Assay-Inkubator.

Starten Sie die Erfassungssoftware und stellen Sie sicher, dass die Einstellungen festgelegt sind, bevor Sie mit der Datenerfassung für das Experiment beginnen. Zeigen Sie die Monitordaten und die Indexnummer in Echtzeit über die DAMSystem-Schnittstelle an. Stellen Sie die Schadstofftemperatur am Inkubator ein, nachdem die definierte Anzahl von Indizes abgelaufen ist und damit das Ende der Eingewöhnungszeit markiert ist.

Überwachen Sie die Aktivitätszählung in Echtzeit über das DAMSystem-Display in der Erfassungssoftware. Alternativ kann es einfacher sein, Aktivitätsdaten direkt in den DAMSystem-Dateien zu überwachen. Kopieren Sie die Textdateien, und öffnen Sie die Kopien anstelle der Originale, um Interferenzen mit der Live-Datenaufzeichnung zu vermeiden.

Nachdem Sie mehrere Minuten lang keine Bewegung bei einer der Fliegen beobachtet haben, stoppen Sie die Erfassungssoftware. Nachdem die Daten erfasst wurden, scannen Sie die Textdateien mit der referenzierten Software auf Fehler. Basierend auf dem implementierten Akklimatisierungsintervall vor der Induktion der schädlichen Temperatur wählen Sie bestimmte Start- und Stopppunkte für das Binning der Aktivitätsdaten aus, bevor Sie die gescannte Datei speichern.

Öffnen Sie nun das HoTDAM! und klicken Sie auf Monitordaten ablegen und laden, um die gescannten Monitordatendateien zu importieren. Fügen Sie Gruppenbezeichnungen hinzu, um die Behandlungsgruppen anzugeben, die jeder Zelle innerhalb der DAM2-Monitore entsprechen.

Klicken Sie auf Multigruppendefinition starten, um das Dialogfeld zum Hinzufügen einer Gruppenbezeichnung zu öffnen. Klicken Sie dann auf die entsprechenden Zellen, um die Gruppenbezeichnung anzuwenden, und klicken Sie auf Multigruppenzuordnung stoppen. Um die TKD für jede Fliege als CSV-Datei zu exportieren, klicken Sie auf Datei, Knockdown-Daten exportieren und Alle Monitore exportieren oder Ausgewählte Monitore exportieren.

Die Ausgabe organisiert den TKD für jeden Flug nach Gruppenbezeichnung. Klicken Sie nun auf Datei, Aktivitätsdaten exportieren und Alle Monitore exportieren oder Ausgewählte Monitore exportieren, um die Aktivitätsdaten für jede Fliege als CSV-Datei zu exportieren, wobei nur der Zeitstempel und die Zähldaten beibehalten werden, um die Datendatei zu vereinfachen, und jeder Fliege bestimmte Gruppenbeschriftungen zugewiesen werden. Gehärtete W1118-Weibchen wiesen im Vergleich zu Kontrollweibchen eine signifikant geringere Wahrscheinlichkeit eines Knockdowns bei Hitzestress auf.

Während bei Männchen kein signifikanter Unterschied beobachtet wurde, wiesen verhärtete TRPA1-Männchen eine signifikant höhere Wahrscheinlichkeit eines Knockdowns im Vergleich zu Kontrollmännchen bei Hitzestress auf, während kein signifikanter Unterschied zwischen abgehärteten und Kontrollweibchen festgestellt wurde. Die durchschnittliche Aktivität während der Hitzetoleranz variierte deutlich zwischen gehärteten und Kontrollgruppen für W1118-Bestände, wobei sowohl bei männlichen als auch bei weiblichen Beständen ein Spitzenwert der Aktivitätszahlen um 30 Minuten zeigte. Die Aktivität bei TRPA1-Aktien zeigte einen starken Anstieg der anfänglichen Aktivität, gefolgt von einem raschen Rückgang für alle Gruppen.