Direktes Vagusnerv-Injektionsprotokoll für Ratten

Wir führen präklinische Studien in der Genersatztherapie durch. Wir verwenden Labortiere, um die optimale Methode der Medikamentenverabreichung zu entwickeln, um Probleme des autonomen und peripheren Nervensystems zu lösen. Die vektorbasierte Genersatztherapie ist eine der aufstrebenden Technologien in der Gentherapie. Die Anwendung des Adino-assoziierten viralen Vektors ist eine der möglichen Optionen, die derzeit verfügbar sind. AAV9 wird in der Gentherapieforschung häufig eingesetzt, um das interessierende Gen in das zentrale und periphere Nervensystem zu bringen. Den Forschern stehen nicht genügend Möglichkeiten zur Verfügung, um Wirkstoffe direkt in das periphere Nervensystem zu bringen. Es gibt Situationen, in denen es um neurologische Störungen geht, die durch das periphere oder das autonome Nervensystem verursacht werden. Es fehlt jedoch an einer wirksamen Methode zur Verabreichung von Medikamenten, um diese Situationen zu bewältigen.

Diese Methode zeigt einen Weg, die Wirkstoffe direkt in die Vagusnerven zu verabreichen, um das Problem des autonomen Nervensystems in präklinischen Studien mit Ratten anzugehen. Darüber hinaus kann diese Methode exportiert werden, um Medikamente durch andere periphere Nerven mit notwendigen Modifikationen in anderen Spezies zu verabreichen. Das graue Labor wird die AV-vermittelte präklinische Gentherapieforschung sowohl mit Nagetieren als auch mit Großtieren fortsetzen. Darüber hinaus konzentrierten wir uns auf die Entwicklung neuer Methoden, um die Strategie der Genersatztherapie zu ebnen.

[Erzähler] Verbinden Sie zunächst eine 100-Mikroliter-Glasspritze mit entferntem Kolben mit einer 27-Gauge-Nadel. Verbinden Sie ein Ende von etwa 45 Zentimetern sterilisiertem Polyethylenschlauch mit der 27-Gauge-Nadel, setzen Sie dann eine Drei-Milliliter-Kunststoffspritze mit einer 27-Gauge-Nadel ein und beladen Sie die Spritze mit ca. 0,5 Millilitern 0,9 % normaler Kochsalzlösung. Verwenden Sie die 0,9%ige normale Kochsalzlösung, um den Polyethylenschlauch vom offenen Ende aus zu füllen, und stellen Sie sicher, dass der Schlauch über die gesamte Länge gefüllt ist, und stellen Sie sicher, dass der Zylinder der Glasspritze gefüllt ist, bis die Kochsalzlösung überläuft. Wenn Sie fertig sind, entfernen und entsorgen Sie die Drei-Milliliter-Spritze und die Nadel. Führen Sie nun den Kolben in den Zylinder der Glasspritze ein, schieben Sie ihn leicht nach vorne in die Mitte des Zylinders und setzen Sie die Glasspritze in die Spritzenpumpe ein. Ziehen Sie den Kolben mit der Spritzenpumpe leicht nach hinten, so dass am offenen Ende des Schlauchs ein Luftraum von etwa 1,5 Zentimetern entsteht. Pipettieren Sie mindestens fünf Mikroliter Farbstoff und Wirkstoffkandidatenmischung mit einer 10-Mikroliter-Mikropipette auf ein sterilisiertes Stück Para-Film. Ziehen Sie das Wirkstoffkandidatengemisch mit Hilfe der Spritzenpumpe in den Schlauch zurück und markieren Sie den Füllstand des Injektionsgemisches mit einem Marker. Setzen Sie eine 35-Gauge-Nadel auf den Schlauch und befestigen Sie sie mit Klebeband auf einer sauberen Oberfläche auf dem Operationstisch, um sicherzustellen, dass sie fixiert und sterilisiert bleibt und nichts anderes berührt. Starten Sie die Spritzenpumpe für 10 bis 15 Sekunden, bis die Injektionslösung aus der Nadelspitze auszutreten beginnt. Bringen Sie die anästhesierte Ratte auf einen Tisch, der für die Haarentfernung und die Vorbereitung der Stelle ausgestattet ist. Tragen Sie künstliche Tränensalbe auf beide Augen der Ratte auf, um übermäßige Trockenheit zu verhindern. Verabreichen Sie Analgetika gemäß dem genehmigten institutionellen Tierprotokoll, um die Schmerzen zu kontrollieren, wenn die Ratte das Bewusstsein wiedererlangt. Rasieren Sie die ventrale Seite des Halses im Halsbereich und verlängern Sie sie bis zu etwa zwei Zentimeter senkrecht von der Mittellinie auf beiden Seiten vom Kinn bis zum Brustbein. Sterilisieren Sie den rasierten Bereich dreimal mit 70 % Ethylalkohol und 10 % Betadin und wischen Sie ihn kreisförmig nach außen. Bringen Sie die Ratte in Rückenlage unter dem Präpariermikroskop in den Operationstisch. Stellen Sie sicher, dass das Heizkissen unter der Ratte richtig temperiert ist, und stellen Sie die Mikroskope so ein, dass die Gebärmutterhalsregion für die Operation sichtbar wird. Haken Sie die Ratten oder Kieferzähne mit einer nicht resorbierbaren Naht ein. Fixieren Sie das offene Ende der Naht im Nasenkonus, um die Nasenlöcher während der Narkose im Nasenkonus zu halten. Positionieren Sie die Ratte so, dass ihr Kopf auf der linken Seite des rechtshändigen Chirurgen liegt. Lege ein sterilisiertes Mullkissen unter den Hals, um den Gebärmutterhalsbereich auszurichten und zu begradigen. Decken Sie den Körper der Ratte mit einem sterilisierten Tuch ab, so dass der Operationsbereich freiliegt. Befestigen Sie vier Retraktorstifte mit magnetischen Fixateuren an den vier Ecken des Operationstisches. Injizieren Sie nun epidermale Lokalanästhetika an der Mittellinie des Gebärmutterhalsbereichs, wo der Schnitt gemacht wird. Verwenden Sie eine Skalpellklinge, um einen zwei Zentimeter langen Hautschnitt an der Mittellinie zwischen Kinn und Brustbein im ventralen Halsbereich zu machen. Dann mit sterilisierten Wattespitzen die Schnittkanten der Haut stumpf trennen. Ziehen Sie die getrennten Hautränder mit den Retraktorspitzen in entgegengesetzte Richtungen zurück. Trennen Sie die Faszie mit Wattestäbchen, um tiefer zu gehen, und schieben Sie die Speicheldrüsen seitlich an. Trennen Sie nun die Brustbein-Mastoidmuskeln mit Wattestäbchen und ziehen Sie sie mit Retraktornadeln seitlich zurück. Fahren Sie mit der Trennung des Gewebes auf der linken Seite der Luftröhre fort, bis die Halsschlagaderscheide sichtbar ist. Erzeugen Sie mit einer feinen Pinzette ein kleines Loch in der Halsschlagader, ohne die Halsschlagader zu beschädigen, und trennen Sie vorsichtig den linken Vagusnerv von der Halsschlagader. Sobald der Nerv mit einer Pinzette von der Arterie getrennt ist, verwenden Sie eine gebogene 25-Gauge-Nadel, die an eine Ein-Milliliter-Spritze angeschlossen ist, zum Einhaken und halten Sie den Nerv mit der nicht dominanten Hand fest. Halten Sie die mit der Wirkstoffmischung beladene Nadel mit der dominanten Hand. Um einen sanften Stich zu erleichtern, halten Sie den Nerv gerade, indem Sie ihn vorsichtig mit dem 25-Gauge-Haken ziehen. Führen Sie die Nadel in den Nerv ein und schieben Sie sie um mehr als 0,5 Zentimeter nach vorne, während Sie die Nadel parallel zum Vagusnerv halten. Ziehen Sie leicht nach hinten, so dass etwa 0,4 bis 0,5 Zentimeter der Nadel im Nerv verbleiben. Begrenzen Sie die Anzahl der Nervenstiche mit einer einzigen Nadel auf nicht mehr als dreimal. Nachdem Sie das Einführen der Nadel bestätigt haben, halten Sie ihre Position ohne Bewegung und schalten Sie die Spritzenpumpe ein. Überwachen Sie die Infusion, um sicherzustellen, dass sie im Nerv bleibt und reibungslos fließt. Verwenden Sie den markierten Punkt auf dem Infusionsschlauch, um die Bewegung der Arzneimittelfarbstoffmischung zu verfolgen. Beobachte, wie der Nerv beginnt, die Farbe des Farbstoffs zu entwickeln. Entfernen Sie die gebogene 25-Gauge-Nadel und bewegen Sie das Taschentuch mit sterilen Wattespitzen vorsichtig zurück in seine ursprüngliche Position. Entfernen Sie dann die Retraktorspitzen. Verschließen Sie die Wunde mit einer resorbierbaren oder nicht resorbierbaren Naht und tragen Sie bei Bedarf eine winzige Menge Gewebekleber zwischen den Nähten auf, um sicherzustellen, dass die Wunde perfekt schließt.