Neuartige und effiziente Methode zur Fluoreszenzfärbung von Drosophila-Herzen mit Kryosektion

Mein Forschungslabor verwendet das Drosophila-Modell, um das Altern und Stoffwechselstörungen zu untersuchen und zeitlich begrenzte Ernährung und Bewegung als Intervention bei Stoffwechsel-, Herzmuskel-, Schlaf- und anderen Alterskrankheiten zu erforschen. Maschinelles Lernen und Omic mit physiologischen, genetischen und ernährungsphysiologischen Strategien rationalisieren den Drosophila-Assay mit 3D-gedruckten Geräten und Ansätzen des maschinellen Lernens. Die fluoreszierende Immunhistochemie von Drosophila-Herzen ermöglicht den Nachweis mehrerer Proteine über Genotypen und Altersgruppen hinweg, steht jedoch vor Herausforderungen wie komplexen Dissektionen, Gewebekonservierung und hochauflösender Bildgebung bestimmter Proteinexpressionsmuster.

Dieses Protokoll verbessert die Gewebekonservierung, die Antikörperpenetration und die Bildgebungsauflösung und ermöglicht eine bessere Visualisierung von kardialen Proteinmarkern. Es adressiert Herausforderungen wie komplexe Dissektionen, Gewebeschäden und begrenzte Auflösung bei der traditionellen Ganzherz-Mount-Methode. Dieses Protokoll verbessert die Zugänglichkeit der Drosophila-Herzforschung, indem es komplexe Dissektionen eliminiert, eine einhändige Ausführung ermöglicht und kostspielige konfokale Mikroskopie vermeidet, wodurch hochauflösende Bildgebung besser möglich wird.

Zu Beginn betäuben Sie 5 bis 10 Fliegen mit einer Kohlendioxid-Fliegenmatte und positionieren Sie die Fliegen unter dem Mikroskop bei 1- bis 2-facher Vergrößerung. Enthaupte mit einer Federschere die Fliegen, schneide die Flügel ab und entferne die Beine.

Halten Sie den Brustkorb und den Bauch zusammen, der als Körper bezeichnet wird. Legen Sie die Körper mit einem Pinsel vorsichtig in beschriftete 1,5-Milliliter-Röhrchen auf Eis, bis alle Versuchsgruppen eingesammelt sind. Nachdem Sie die Röhrchen aus dem Eis genommen haben, geben Sie 100 Mikroliter 10 Millimolare Ethylenglykoltetraessigsäure bei einem pH-Wert von 8 in jedes Röhrchen.

Stellen Sie sicher, dass alle Körper untergetaucht sind, und legen Sie die Röhrchen für 10 Minuten auf einen Orbitalschüttler. Entfernen und entsorgen Sie dann die Ethylenglykoltetraessigsäurelösung aus den Röhrchen. Pipettieren Sie 100 Mikroliter PBS in jedes Röhrchen, um das Gewebe 10 Minuten lang zu waschen.

Legen Sie die Tuben während des Waschvorgangs auf den Orbitalschüttler. Nachdem Sie das PBS verworfen haben, pipettieren Sie 100 Mikroliter 4%iges Paraformaldehyd in PBS-Lösung in jedes Röhrchen. Legen Sie die Röhrchen 15 Minuten lang bei 100 Einheiten auf einen Orbitalschüttler und stellen Sie sicher, dass das Gewebe in Kontakt mit der Lösung bleibt.

Entsorgen Sie dann die Paraformaldehydlösung. Sobald die letzte Wäsche abgeschlossen ist, überführen Sie die Körper in eine Lösung von 10%iger Saccharose in PBS. Stellen Sie sicher, dass die Körper mit der Lösung im Röhrchen in Kontakt kommen.

Nehmen Sie Trockeneis aus dem Lager und wählen Sie einige Stücke aus, um sie in eine kleine Metall- oder Kunststoffschale zu legen. Wählen Sie ein Tablett mit den Abmessungen, in die die Form eingesetzt werden kann, und platzieren Sie sie direkt auf einem einzigen großen und flachen Stück Trockeneis. Füllen Sie eine beschriftete Form zu 50 % mit optimaler Schnitttemperatur oder OCT-Verbindung und gießen Sie langsam, um Blasen zu minimieren.

Legen Sie die präparierten und fixierten Drosophila-Körper vorsichtig mit einem Pinsel auf die Oberfläche der OCT-Verbindung innerhalb der Form. Schieben Sie jeden Körper mit einer Pinzette auf den Boden der Form, wobei die Rückenwand des Brustkorbs und des Bauches im Allgemeinen entlang des Bodens ausgerichtet ist. Passen Sie die Körper so an, dass der Bauch flach am Boden der Form anliegt.

Richten Sie alle Körper in den Dimensionen X, Y und Z aus, um sicherzustellen, dass jeder Abschnitt alle Motive gleichzeitig enthält. Korrigieren Sie die Krümmung des Bauches, insbesondere bei Männern, um ihn so weit wie möglich abzuflachen, ohne den Körper zu durchstechen oder zu quetschen. Sobald alle Motive an Ort und Stelle sind, positioniere die Form so, dass der Boden direkt auf einem Stück Trockeneis sitzt.

Stellen Sie sicher, dass die OCT-Verbindung bei Kontakt zu gefrieren beginnt, und fahren Sie fort, bis alle Motive vollständig in der Form eingeschlossen sind. Nach dem Einfrieren stellen Sie die Form in einen Gefrierschrank, der auf minus 20 Grad Celsius eingestellt ist, um ein vollständiges Einfrieren zu ermöglichen. Sobald sie vollständig gefroren ist, füllen Sie den restlichen Teil der Form mit OCT-Masse.

Um einen Bohrbohrer an der Form zu befestigen, tragen Sie eine großzügige Menge OCT-Masse auf den Block auf. Drücken Sie das Bit flach auf die Verbindung und lassen Sie es im Kryostaten vollständig einfrieren, in der Regel innerhalb von fünf Minuten. Lösen Sie dann den Bohrbohrer und den OCT-Block aus der Form.

Setzen Sie den Bohrer in das Bohrfutter ein, stellen Sie sicher, dass der Block von oben nach unten richtig ausgerichtet bleibt, und ziehen Sie den Bohrfutterschlüssel fest, um den Bohrer zu sichern. Richten Sie nun den Block mit den Einstellknöpfen und den Futtertiefenreglern an der Klinge aus und stellen Sie die Schnittbreite auf 20 Mikrometer oder weniger ein. Schneiden Sie jede Scheibe mit einer langsamen, aber gleichmäßigen Bewegung aus dem Block ab, sodass das Anti-Roll-Glas jede Scheibe beim Schneiden erfassen kann.

Sammeln Sie die Abschnitte mit erwärmten Folien. Entfernen Sie mit einer Rasierklinge die überschüssige OCT-Masse, die die Abschnitte umgibt. Umreißen Sie den Rand jedes Objektträgers mit einem hydrophoben Marker, um Wasch- und Fleckenlösungen auf das Gewebe zu beschränken.

Waschen Sie die Objektträger mit einer 1000-Mikroliter-Pipette dreimal jeweils fünf Minuten lang mit PBS, ohne das Gewebe zu berühren. Nachdem Sie die letzte Wäsche verworfen haben, pipettieren Sie die fluoreszierende Färbelösung auf das Gewebe und inkubieren Sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur im Dunkeln. Entsorgen Sie dann den fluoreszierenden Fleck und waschen Sie die Objektträger dreimal für jeweils fünf Minuten mit PBS.

Entsorgen Sie anschließend die letzte PBS-Wäsche und lassen Sie eine kleine Menge Lösung auf dem Objektträger. Pipettieren Sie mit einer 1000-Mikroliter-Pipette drei bis fünf Tropfen Einbettmedium auf den Objektträger, wobei ein direktes Auftragen auf das Gewebe vermieden wird. Positionieren Sie den Deckglas mit einer Pinzette an einer Kante und senken Sie die andere Seite allmählich ab, bis er bündig mit dem Objektträger abschließt.

Versiegeln Sie Dias mit Nagellack ohne Neon oder Glitzer. Wenn das Eindeckmedium je nach Fluoreszenzfleck nicht aushärtet, bebildern Sie die Dias sofort oder bewahren Sie sie für später auf. Überprüfen Sie die Objektträger vor der Bildgebung auf Sauberkeit und reinigen Sie sie vorsichtig mit einem Taschentuchtuch mit einer 70%igen Ethanol-in-Wasser-Lösung.

Analysieren Sie die hellsten fluoreszierenden Probanden innerhalb des Experiments, um geeignete Belichtungszeiten für jeden Fluoreszenzkanal auszuwählen. Untersuchen Sie jede Versuchsgruppe in einer Live-Ansicht für alle Kanäle, um die korrekten Belichtungseinstellungen zu bestätigen. Um die Konsistenz zu gewährleisten, fokussieren Sie sich auf jedes Motiv mit demselben Fluoreszenzkanal und nehmen Sie Bilder für alle Motive auf.

Bewahren Sie die Dias nach der Bildgebung im Dunkeln bei vier Grad Celsius auf, damit das Bild später wieder aufgenommen werden kann. Das Fluoreszenzbildgebungsverfahren bewahrte Schlüsselmerkmale des Drosophila-Herzens, wie die Ostien, die Klappe, die Längsfasern und die Umfangsfasern. Die gesamte Herzrohrstruktur und detaillierte Nebenstrukturen wurden in verschiedenen Vergrößerungen erfasst, wobei die gesamte Struktur mit 10-facher und mit 40- bis 60-facher Vergrößerung feinere Details wie z. B. umlaufende kontraktile Fasern und longitudinalstabilisierende Fasern gezeigt wurden.

Repräsentative fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen zeigten erhaltene Herzstrukturen in w1118-Drosophila mit DAPI-gefärbten Zellkernen, grün gefärbten Lipiden und aktinhaltigen Myofibrillen, die mit Phalloidin rot gefärbt wurden. Die Phalloidinfärbung hob Längs- und Umfangsfasern effektiv hervor und zeigte die erhaltene Aktinfilamentstruktur trotz Gefrier- und Schnittbelastungen. Die Lipidfleckenfärbung ergab Fettspeicher, die in der Nähe des Herzschlauchs lokalisiert waren.