Entwicklung und Bewertung von intrazellulären Infektionsmodellen für Staphylococcus aureus

Unsere Forschung konzentriert sich auf Staphylococcus aureus-Infektionen mit dem Ziel, ein interzelluläres Infektionsmodell zu etablieren. Dieses Modell wird wertvolle Einblicke in den Mechanismus liefern, der interzellulären Infektionen zugrunde liegt, und zur Entwicklung eines strengen Alters für deren Prävention und Behandlung beitragen. Der neueste Fortschritt bei der intrazellulären Infektion von Staphylococcus aureus besteht darin, den Infektionsmechanismus zu untersuchen, um das Überleben und die Ausbreitung von Bakterien innerhalb der Zelle zu regulieren, und wird dazu beitragen, das Medikament und die strukturelle Modifikation zu optimieren, um die therapeutische Wirkung zu verbessern.

In diesem Forschungsbereich werden Zellkulturen, Sequenzierungstechnologien für entstehende Zellen, Oxytherms mit hohem Brennstoffgehalt, Gen-Editing-Technologie und andere verwandte Technologien eingesetzt, um Bakterieninfektionen in Zellen zu untersuchen. Im Gegensatz zu herkömmlichen Infektionsmodellen haben wir die experimentellen Bedingungen, die für intrazelluläre Infektionen spezifisch sind, verfeinert. Nachdem die Zellen einzeln mit Staphylococcus aureus infiziert wurden, werden die bakteriell infizierten Zellen dann in Mäuse geimpft, um intrazelluläre Infektionen zu etablieren.

Dieser Ansatz verbessert die Effizienz, indem er die Interferenz der freien Bakterien minimiert und eine genauere Speicherung des intrazellulären Infektionsprozesses gewährleistet. Unsere Methode wird sich auf die Entwicklung von Antikörper-Medikamenten konzentrieren und in Zukunft bakterielle Infektionen verhindern und behandeln. Um eine 6%ige Stärkebrühe zuzubereiten, geben Sie Rindfleischextraktpulver, Trypton und Natriumchlorid nacheinander im Massenverhältnis von 3 bis 10 zu 5 in einen Glasbehälter.

Fügen Sie 100 Milliliter doppelt destilliertes Wasser hinzu und rühren Sie um, um die Bestandteile aufzulösen. Erhitzen Sie die Lösung in der Mikrowelle. Fügen Sie dann lösliche Stärke in einem Massenverhältnis von 6 hinzu und rühren Sie die Mischung, bis sie sich vollständig aufgelöst hat.

Autoklavieren Sie die Brühe bei 121 Grad Celsius für 30 Minuten. Nach dem Sterilisieren die Brühe bei vier Grad Celsius lagern, bis sie eine Paste bildet. Um Peritonealmakrophagen der Maus zu sammeln, greifen Sie mit der linken Hand nach dem Hals der Maus und steuern Sie ihren Schwanz.

Drehen Sie dann die Maus so, dass der Kopf nach unten und der Bauch nach oben zeigt. Verabreichen Sie der Maus eine intraperitoneale Injektion von drei Millilitern 6%iger Stärkebrühe. Nach 72 Stunden Injektion die betäubte Maus opfern und mit 75%igem Ethylalkohol desinfizieren.

Schneiden Sie mit einer Augenschere den Bauch der Maus auf, um das Bauchfell vollständig freizulegen. Injizieren Sie 10 Milliliter DMEM durch intraperitoneale Injektion in die Bauchhöhle. Reiben Sie den Bauch eine Minute lang sanft, um die Höhle zu spülen.

Verwenden Sie dann eine Spritze, um die gespülte Flüssigkeit in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen zu füllen. Die Spülflüssigkeit wird fünf Minuten lang bei 300 g zentrifugiert, und der Überstand wird verworfen. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 10 Millilitern DMEM, ergänzt mit 10% FBS, Penicillin und Streptomycin.

Nehmen Sie 10 Mikroliter Zellsuspension und geben Sie sie in den Zellzähler, um die Zellen zu zählen. Verdünnen Sie die Zellen auf eine Konzentration von 2 mal 10 hoch 6 Zellen pro Milliliter mit DMEM FBS. Platten Sie einen Milliliter Zellsuspension pro Vertiefung auf eine Platte mit sechs Vertiefungen.

Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid für vier Stunden. Nach der Inkubation ist der Überstand zu entfernen. Waschen Sie die Zellen zweimal mit sterilem PBS und kultivieren Sie sie über Nacht mit einem Milliliter DMEM pro Vertiefung unter den gleichen Bedingungen.

Inkubieren Sie die Peritonealmakrophagen zwei Stunden lang mit Staphylococcus aureus MRSA-252. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS. Fügen Sie einen Milliliter pro Mulde vollständiges DMEM-Medium hinzu, das 100 Mikrogramm Gentamicin pro Milliliter enthält, und inkubieren Sie zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid.

Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation dreimal mit PBS. Sammeln Sie die Peritonealmakrophagen mit einem Zellschaber in 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Die Proben werden fünf Minuten lang bei 1000 g zentrifugiert.

Geben Sie 10 Mikrogramm pro Milliliter Lysozym zu den Makrophagen, die mit intrazellulärem MRSA-252 infiziert sind, und inkubieren Sie 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Nachdem Sie die Zellen zweimal mit PBS gewaschen haben, suspendieren Sie sie wieder in einem Milliliter PBS. Nehmen Sie dann etwa 20 Mikroliter Aliquot heraus und fügen Sie fünf Minuten lang 0,1 % Triton X-100 hinzu, um die Zellen zu lysieren.

Führen Sie serielle Verdünnungen der lysierten Zellsuspension mit PBS durch und geben Sie sie auf eine tryptische Sojaschneckenplatte. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius. Zählen Sie am nächsten Tag die Bakterienkolonien, um die intrazellulären MRSA-252-Bakterien in Peritonealmakrophagen zu berechnen.

Legen Sie die Maus unter eine Infrarot-Physiotherapielampe, bis die Schwanzvene erweitert ist. Teilen Sie die Mäuse nach dem Zufallsprinzip in vier Gruppen ein. Intravenös 3 mal 10 hoch 6 KBE Planktonic MRSA-252 in die Schwanzvene der Maus injizieren.

Nach 24 Stunden die betäubte Maus opfern und gründlich mit 75%igem Ethylalkohol desinfizieren. Verwenden Sie mit einer Pinzette eine Pinzette, um die Bauchhaut anzuheben, und schneiden Sie mit der anderen Hand die Haut mit einer Augenschere auf. Lokalisieren Sie die Nieren in der Bauchhöhle und entfernen Sie sie vorsichtig vollständig.

Übertragen Sie die Nieren in ein Mahlröhrchen, das einen Milliliter PBS enthält, und mahlen Sie sie, bis kein festes Gewebe mehr übrig ist. Gießen Sie das homogenisierte Gewebe in das Eppendorf-Röhrchen. Führen Sie serielle Verdünnungen des Gewebehomogenats mit PBS durch.

Tüten Sie jede Verdünnung auf separate Triptychon-Sojaschneckenplatten und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 Grad Celsius. Zählen Sie die Bakterienkolonien am nächsten Tag und analysieren Sie die Daten. Intrazelluläre Infektionsmodelle von S.aureus wurden erfolgreich unter optimierten Phagozytosebedingungen und erweiterter Antibiotikabehandlung etabliert, wobei einige Bakterien in Makrophagen überlebten.

Makrophagen, die mit Methicillin-resistentem S. aureus infiziert waren, behielten nach zweistündiger Antibiotikabehandlung intrazelluläre Bakterien zurück, wenn der Überstand keine Bakterien mehr enthielt. In vivo zeigten bakterielle Besiedlungsassays an Mäusen, dass Vancomycin extrazelluläre S. aureus eliminierte, intrazelluläre Bakterien jedoch nicht beseitigte.