Onkogen-Expressionsanalyse mit Veränderungen des pH-Werts in einer duktalen Pankreaszelllinie

In den AIG-Kliniken untersuchen wir, wie sich eine verminderte Gangsekretion der Bauchspeicheldrüse und ein verringerter pH-Wert auf die Genexpression in den duktalen Zellen der Bauchspeicheldrüse auswirken, wobei wir uns insbesondere auf die Onkogene konzentrieren und die Möglichkeit der zellulären Anpassung an saure Mikroumgebungen untersuchen. Die Herausforderung hierbei ist die Heterogenität der Pankreastumoren, die sowohl die Behandlung als auch die experimentellen Ansätze erschwert. Daher führten wir RNAC-Analysen von duktalen Zellen der Bauchspeicheldrüse unter reduzierten pH-Bedingungen durch und fanden heraus, dass es eine erhöhte Expression von drei Onkogenen gibt, was die potenziellen Zusammenhänge zwischen dem sauren Milieu und der Onkogenexpression in duktalen Zellen der Bauchspeicheldrüse unterstreicht.

Unsere Studie hat Licht auf die Onkogenexpression unter reduzierten pH-Bedingungen geworfen, und dieses System kann unsere Forschung zur Untersuchung des duktalen Adenokarzinoms der Bauchspeicheldrüse unter Entzündungsbedingungen vorantreiben. Das zukünftige Ziel dieser Studie besteht daher darin, die Rolle erhöhter Onkogenexpressionen bei der Initiierung von Tumoren unter entzündlichen Bedingungen, wie z.B. bei chronischer Pankreatitis, zu untersuchen. Beschaffen Sie sich zunächst die normale duktale Bauchspeicheldrüsenzelllinie.

Tauen Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in einem Wasserbad auf. Filtrieren Sie nun das frisch vorbereitete komplette Medium durch einen Spritzenfilter. Geben Sie sechs Milliliter des vollständigen Mediums in ein neues konisches 15-Milliliter-Röhrchen.

Übertragen Sie dann die aufgetaute Zellsuspension in das Röhrchen und mischen Sie sie gründlich. Die Suspension wird sechs Minuten lang bei 1.800 g zentrifugiert. Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie dem Pellet einen Milliliter Nährmedium hinzu, bevor Sie es vorsichtig mischen.

Geben Sie dann vier Milliliter des kompletten Mediums in eine 60-Millimeter-Petrischale. Dann pipettieren Sie die Zellsuspension tropfenweise in den Kolben. Inkubieren Sie die Kultur bei 37 Grad Celsius unter 5 % Kohlendioxidzusatz.

Um den pH-Wert des Nährmediums zu ändern, bereiten Sie zunächst 100 Milliliter 0,5 molare Natriumphosphat-Pufferlösungen mit pH-Werten von 6,0, 6,5 und 7,0 vor. Überprüfen Sie den pH-Wert mit einem pH-Messgerät und stellen Sie ihn mit einer molaren Salzsäure oder einem molaren Natriumhydroxid ein. Filtrieren Sie dann und sterilisieren Sie die Puffer in einer Laminar-Airflow-Haube mit einem 0,45-Mikrometer-Spritzenvorsatzfilter.

Als nächstes fügen Sie 20 Milliliter sterilen 0,5-molaren Natriumphosphatpuffer des jeweiligen pH-Werts zu 80 Millilitern Nährmedium hinzu, um Medien mit unterschiedlichem pH-Wert herzustellen. Geben Sie das Medium mit dem veränderten pH-Wert zu 85 bis 90 % konfluenten menschlichen Pankreas-Gangzellen. Beobachten Sie morphologische Veränderungen unter einem Hellfeldmikroskop im Abstand von einer Stunde für sechs Stunden.

Um RNA aus der Kultur zu isolieren, aspirieren Sie zunächst das Kulturmedium und spülen die Zellen mit einem Milliliter PBS. Stellen Sie die 60-Millimeter-Schale auf Eis, geben Sie dann einen Milliliter PBS in die 60-Millimeter-Schale und kratzen Sie die Zellen mit einem Zellschaber ab. Übertragen Sie nun die Suspension in eine frische Tube.

Zentrifugieren Sie es 10 Minuten lang bei 8.000 g und verwerfen Sie den Überstand. Als nächstes fügen Sie dem Pellet 600 Mikroliter Lysepuffer hinzu, der Beta-Mercaptoethanol enthält. Pipettieren Sie die Suspension fünf bis 10 Minuten lang auf Eis auf und ab.

Geben Sie das gleiche Volumen von 70 % Ethanol in das Lysat und pipettieren Sie die Suspension, um sie gründlich zu mischen. Übertragen Sie die Lösung in eine Kieselsäuremembransäule. Zentrifugieren Sie dann die Säule 30 Sekunden lang bei mehr als 8.000 g und verwerfen Sie den Durchfluss.

Geben Sie anschließend 500 Mikroliter Waschpuffer in die Probe und zentrifugieren Sie erneut. Zentrifugieren Sie das leere Röhrchen eine Minute lang bei mehr als 8.000 G.Zum Schluss geben Sie 30 bis 50 Mikroliter nukleasefreies Wasser in die Säule. Nach einer fünfminütigen Inkubation bei Raumtemperatur wird die Säule erneut fünf Minuten lang bei Geschwindigkeiten von mehr als 8.000 g zentrifugiert.

Es wurde eine signifikante Verringerung der Zellgröße und der Schrumpfung duktiler Zellen in saurem Medium im Vergleich zu Zellen beobachtet, die in einem normalen Medium gehalten wurden. Die ausgeprägtesten Veränderungen des Zelltods traten nach sechsstündiger Inkubation auf, mit einer weiteren Abnahme der Zellzahl und Anzeichen von zellulärem Stress nach 22 Stunden. Die Anzahl der hochregulierten Gene war bei pH 6,5 mit 148 Genen am höchsten, gefolgt von pH sieben mit 109 Genen und pH sechs mit 90 Genen.

Die herunterregulierten Gene waren mit 20 bei pH sechs, 14 bei pH 6,5 und 23 bei pH sieben geringer. Drei Onkogene, LCK, FGR und ASAP drei waren über alle getesteten pH-Werte hochreguliert, was auf eine Rolle bei der Zellproliferation unter sauren Bedingungen hindeutet.