Isolierung und Kultivierung von primären murinen Adipozyten aus mageren und adipösen Mäusen

Unsere Forschung konzentriert sich auf die Untersuchung der Funktion reifer Adipozyten aus verschiedenen Fettdepots und Ernährungsbedingungen. Wir sind insbesondere daran interessiert zu verstehen, wie reife Adipozyten mit umgebenden Zellen kommunizieren und wie diese Wechselwirkung das Fortschreiten der Krankheit beeinflussen und bei Fettleibigkeit verändert werden kann. Reife Adipozyten sind große und empfindliche Zellen, was die häufig verwendeten Zellisolationsmethoden wie FACS unwirksam macht.

Darüber hinaus können hohe Konzentrationen an freien Lipiden, die häufig im Fettgewebe vorkommen, für reife Adipozyten giftig sein und ihre Erhaltung erschweren. Im Gegensatz zu häufig verwendeten Methoden, die auf der in vitro Differenzierung von Präadipozyten beruhen, ermöglicht uns dieses Protokoll, ex vivo isolierte Adipozyten zu untersuchen, die funktionell und transkriptionell wie in vivo Adipozyten sind. Dies ist besonders wichtig, da Adipozyten zwischen Fettdepots und unter verschiedenen Ernährungsbedingungen stark variieren.

Dieses Protokoll isoliert effizient und spiegelt reife Adipozyten und ist leicht skalierbar. Es sind Anpassungen enthalten, um die Isolierung von Adipozyten von Mäusen unterschiedlichen Geschlechts und mit unterschiedlichen Ernährungsbedingungen zu optimieren. Nach der Isolierung können die Adipozyten je nach Bedarf kultiviert, abgebildet oder anderweitig verwendet werden.

Bereiten Sie zunächst eine Kollagenaselösung mit DNase vor, indem Sie 0,00017 Gramm DNase pro einem Milliliter Kollagenaselösung hinzufügen und die Mischung wirbeln, um eine vollständige Durchmischung zu gewährleisten. Mit einer Rasierklinge das isolierte Fettgewebe der Mäuse zerkleinern, bis es homogen erscheint. Anschließend geben Sie das Hackfleisch in ein steriles konisches 50-Milliliter-Röhrchen.

Geben Sie die vorbereitete Kollagenase und DNase-Lösung in das gehackte Fettgewebe und wirbeln Sie sie sieben bis 10 Sekunden lang bei maximaler Geschwindigkeit, um die Komponenten gründlich zu mischen. Legen Sie dann die konischen 50-Milliliter-Röhrchen für 10 Minuten horizontal in einen auf 220 U/min bei 37 Grad Celsius eingestellten Shaker. Nach der Inkubation die Röhrchen entfernen, fünf Sekunden lang wirbeln und die Proben überprüfen.

Nun wird das verdaute Gewebe mit einer serologischen Pipette durch ein Sieb in ein neues, steriles konisches 50-Milliliter-Röhrchen geleitet. Geben Sie FBS in Höhe des Gewebevolumens und der Kollagenaselösung durch das Sieb in dasselbe konische Röhrchen, um die Kollagenase zu neutralisieren. Schleudern Sie die Röhrchen drei Minuten lang bei 300 g bei der in der hier gezeigten Tabelle angegebenen Temperatur.

Entsorgen Sie dann mit einer 200-Mikroliter-Pipette vorsichtig die oberste Schicht der freien Lipide. Verwenden Sie anschließend eine P1000-Pipette mit abgeschnittener Spitze, um die reifen Adipozyten in ein vorbereitetes 15-Milliliter-Röhrchen mit 10 Millilitern Wachstumsmedium zu übertragen. Drehen Sie die 15-Milliliter-Röhrchen mit reifen Adipozyten drei- bis fünfmal vorsichtig um, bis sich die weiße Schicht im Medium verteilt.

Nachdem Sie die Röhren 10 Minuten ruhen gelassen haben, drehen Sie sie bei der zuvor festgelegten Temperatur, um die Schichten weiter zu trennen. Verwenden Sie danach eine Pipette, um die oberste Schicht der freien Lipide zu entsorgen. Befestigen Sie nun eine 21-Gauge-Nadel an einer Fünf-Milliliter-Spritze und schieben Sie die Nadel vorsichtig am Rand des Röhrchens hinunter, bis sich die Unterseite der Nadel unter der Schicht an der Stelle der reifen Adipozyten befindet.

Ziehen Sie dann die Spritze langsam nach oben, um das Nährmedium und alle Zelltrümmer zu entfernen. Geben Sie vorsichtig 10 Milliliter Nährmedium in das Röhrchen. Verwenden von Pipettenspitzen mit Gelladefunktion Schieben Sie die Spitze am Rand des Röhrchens nach unten, um das restliche Medium unter der reifen Adipozytenschicht zu entfernen.

Dann zentrifugieren Sie die Zellen eine Minute lang bei 100 g. Mit einer Pipette die freien Lipide entfernen. Entfernen Sie mit einer Pipettenspitze zum Laden des Gels das Nährmedium unter den Adipozyten.

Entnehmen Sie die Zellkultureinsätze von einer mit Gewebekulturen behandelten 24-Well-Platte und legen Sie sie mit der Membranseite nach oben auf die Oberfläche der Haube. Füllen Sie die abwechselnden Vertiefungen der Platte mit warmen Nährmedien. Übertragen Sie mit einer geschnittenen P200-Pipettenspitze 30 Mikroliter gepackter reifer Adipozyten auf die Oberseite eines Transwell-Einsatzes.

Nehmen Sie dann vorsichtig den Transwell-Einsatz auf, drehen Sie ihn um und legen Sie ihn in eine vorgefüllte Vertiefung in der 24-Well-Platte. Um das Medium aus den Vertiefungen zu entfernen, halten Sie den Transwell-Einsatz ruhig und saugen Sie mit einer P200-Pipette durch die kleinen Öffnungen an den Seiten. Nachdem Sie das Medium entfernt haben, während Sie den Transwell immer noch an Ort und Stelle halten, fügen Sie langsam einen Milliliter frisches Medium entlang der Seitenwand des Wells hinzu.