Name: Isolierung und Kultivierung von primären murinen Adipozyten aus mageren und adipösen Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-24T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 34 s
Description: Lernen Sie die Isolierung reifer Adipozyten aus verschiedenen Fettdepots bei unterschiedlichen Ernährungsbedingungen. Diese skalierbare Methode ermöglicht funktionelle Analysen für die Adipositas-Forschung.

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<meta charset="utf8"></head><body>Kultivierung von murinen Adipozyten und Explantaten für funktionelle und bildgebende Untersuchungen

<ol><li>Ward, Z. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projected+U.S.+state-level+prevalence+of+adult+obesity+and+severe+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Projected U.S. state-level prevalence of adult obesity and severe obesity.</a> N Engl J Med. 381 (25), 2440-2450 (2019).</li>
<li>Vishvanath, L., Gupta, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+adipogenesis+to+healthy+adipose+tissue+expansion+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Contribution of adipogenesis to healthy adipose tissue expansion in obesity.</a> J Clin Invest. 129 (10), 4022-4031 (2019).</li>
<li>Longo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+dysfunction+as+determinant+of+obesity-associated+metabolic+complications%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue dysfunction as determinant of obesity-associated metabolic complications.</a> Int J Mol Sci. 20 (9), 2358(2019).</li>
<li>Funcke, J. B., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+adiponectin+and+leptin%3A+Adipose+tissue-derived+mediators+of+inter-organ+communication%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Beyond adiponectin and leptin: Adipose tissue-derived mediators of inter-organ communication.</a> J Lipid Res. 60 (10), 1648-1684 (2019).</li>
<li>Johnston, E. K., Abbott, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+paracrine-%2C+autocrine-%2C+and+matrix-dependent+signaling+during+the+development+and+progression+of+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue paracrine-, autocrine-, and matrix-dependent signaling during the development and progression of obesity.</a> Cells. 12 (3), 407(2023).</li>
<li>Koenen, M., Hill, M. A., Cohen, P., Sowers, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity%2C+adipose+tissue+and+vascular+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Obesity, adipose tissue and vascular dysfunction.</a> Circ Res. 128 (7), 951-968 (2021).</li>
<li>Liu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+and+lipidomic+profiling+of+subcutaneous+and+visceral+adipose+tissues+in+15+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Data%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic and lipidomic profiling of subcutaneous and visceral adipose tissues in 15 vertebrates.</a> Sci Data. 10 (1), 453(2023).</li>
<li>Wu, Y., Li, X., Li, Q., Cheng, C., Zheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue-to-breast+cancer+crosstalk%3A+Comprehensive+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue-to-breast cancer crosstalk: Comprehensive insights.</a> Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 1877 (5), 188800(2022).</li>
<li>Emont, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+atlas+of+human+and+mouse+white+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single-cell atlas of human and mouse white adipose tissue.</a> Nature. 603 (7903), 926-933 (2022).</li>
<li>Nahmgoong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+properties+of+adipose+stem+cell+subpopulations+determine+fat+depot-specific+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Distinct properties of adipose stem cell subpopulations determine fat depot-specific characteristics.</a> Cell Metab. 34 (3), 458-472.e6 (2022).</li>
<li>Hildreth, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing+of+human+white+adipose+tissue+identifies+new+cell+states+in+health+and+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing of human white adipose tissue identifies new cell states in health and obesity.</a> Nat Immunol. 22 (5), 639-653 (2021).</li>
<li>Maniyadath, B., Zhang, Q., Gupta, R. K., Mandrup, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue at single-cell resolution.</a> Cell Metab. 35 (3), 386-413 (2023).</li>
<li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocytes+promote+breast+tumorigenesis+through+taz-dependent+secretion+of+resistin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Adipocytes promote breast tumorigenesis through taz-dependent secretion of resistin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (52), 33295-33304 (2020).</li>
<li>Cornide-Petronio, M. E., Jimenez-Castro, M. B., Gracia-Sancho, J., Peralta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+liver-visceral+adipose+axis+during+hepatic+resection+and+liver+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">New insights into the liver-visceral adipose axis during hepatic resection and liver transplantation.</a> Cells. 8 (9), 1100(2019).</li>
<li>Verma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc-alpha-2-glycoprotein+secreted+by+triple-negative+breast+cancer+promotes+peritumoral+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Zinc-alpha-2-glycoprotein secreted by triple-negative breast cancer promotes peritumoral fibrosis.</a> Cancer Res Commun. 4 (7), 1655-1666 (2024).</li>
<li>Min, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+repertoire+of+human+adipocyte+subtypes+develops+from+transcriptionally+distinct+mesenchymal+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Diverse repertoire of human adipocyte subtypes develops from transcriptionally distinct mesenchymal progenitor cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (36), 17970-17979 (2019).</li>
<li>Harms, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+human+white+adipocytes+cultured+under+membranes+maintain+identity%2C+function%2C+and+can+transdifferentiate+into+brown-like+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Mature human white adipocytes cultured under membranes maintain identity, function, and can transdifferentiate into brown-like adipocytes.</a> Cell Rep. 27 (1), 213-225.e5 (2019).</li>
<li>Chaurasiya, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+visceral+adipose+tissue+microvascular+endothelial+cell+isolation+and+establishment+of+co-culture+with+white+adipocytes+to+analyze+cell-cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Human visceral adipose tissue microvascular endothelial cell isolation and establishment of co-culture with white adipocytes to analyze cell-cell communication.</a> Exp Cell Res. 433 (2), 113819(2023).</li>
<li>Galmozzi, A., Kok, B. P., Saez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+differentiation+of+primary+white+and+brown+pre-adipocytes+from+newborn+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and differentiation of primary white and brown pre-adipocytes from newborn mice.</a> J Vis Exp. 167, e62005(2021).</li>
<li>Farrar, J. S., Martin, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+the+stromal+vascular+fraction+from+adipose+tissue+and+subsequent+differentiation+into+white+or+beige+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of the stromal vascular fraction from adipose tissue and subsequent differentiation into white or beige adipocytes.</a> Methods Mol Biol. 2455, 103-115 (2022).</li>
<li>You, X., Gao, J., Yao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+methods+to+mechanically+isolate+stromal+vascular+fraction%3A+A+concise+review%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Ther%22%5BJournal%5D)">Advanced methods to mechanically isolate stromal vascular fraction: A concise review.</a> Regen Ther. 27, 120-125 (2024).</li>
<li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitor+cell+isolation+from+mouse+epididymal+adipose+tissue+and+sequencing+library+construction%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Progenitor cell isolation from mouse epididymal adipose tissue and sequencing library construction.</a> STAR Protoc. 4 (4), 102703(2023).</li>
<li>Cho, D. S., Doles, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+adipose+progenitor+cells+from+mouse+epididymal+adipose+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of adipose progenitor cells from mouse epididymal adipose tissues.</a> J Vis Exp. 162, e61694(2020).</li>
<li>Lauschke, V. M., Hagberg, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+human+adipose+tissue+culture+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Next-generation human adipose tissue culture methods.</a> Curr Opin Genet Dev. 80, 102057(2023).</li>
<li>Alexandersson, I., Harms, M. J., Boucher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+human+mature+adipocytes+using+membrane+mature+adipocyte+aggregate+cultures+%28MAAC%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of human mature adipocytes using membrane mature adipocyte aggregate cultures (MAAC).</a> J Vis Exp. 156, e60485(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>100x Poloxamer 188 Lösung</td><td>Sigma</td><td>P5556-100mL</td><td></td></tr><tr><td>15 mL konisch Cellstar</td><td></td><td>188261</td><td></td></tr><tr><td>21 G Nadel</td><td>BD</td><td>305165</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Spritze</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>50 mL konisch</td><td>Cellstar</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>6,5 mm Transwell mit 0,4 & Mikro; m Poren-Polycarbonat-Membraneinsatz</td><td>Corning</td><td>3413</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016-500gm</td><td></td></tr><tr><td>CellMask Plasmamembran-Färbungen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10045</td><td></td></tr><tr><td>CL 316243 Dinatriumsalz</td><td>Tocris</td><td>1499</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase Pulver</td><td>Sigma</td><td>C6885</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11995-040</td><td></td></tr><tr><td>DMEM ohne Pheonol Rot</td><td>Gibco</td><td>A14430-01</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>A56708-01</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Tissue Path Superfrost Plus Gold Objektträger</td><td>Fisher scientific</td><td></td><td></td>1518848</tr><tr><td>Gel Loading Pipettenspitze</td><td>Fisher scientific</td><td>02-707-181</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol Assay Kit</td><td>Abcam</td><td>AB133130</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Buffer</td><td>Sigma</td><td>83264-100ml-F</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Megafuge 16R Zentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td>75004271</tr><tr><td>Hoechst 33342 Solution</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Inkubierender Mini-Schüttler</td><td>VWR</td><td>12620-942</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4530</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop-Deckgläser</td><td>VWR</td><td>16004-302</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>SecureSeal Imaging Spacer</td><td>Grace Biolabs</td><td>654006</td><td></td></tr><tr><td>Seive (SteeL Feinmaschiges Cocktailsier)</td><td>OXO</td><td>3112000</td><td>https://www.oxo.com/steel-fine-mesh-cocktail-strainer-660.html</td></tr></tbody></table>

isolierung und kultivierung von primären murinen adipozyten aus mageren und adipösen mäusen

Isolation and Culturing of Primary Murine Adipocytes from Lean and Obese Mice

Wie in Abbildung 2 gezeigt, sind das richtige Zerkleinern (Abbildung 2B) und der richtige Verdau (Abbildung 2C) wichtig für die Isolierung intakter reifer Adipozyten. Unterminierung und Unterverdauung können aufgrund einer unzureichenden Trennung vom Bindegewebe zu einer geringen Ausbeute an reifen Adipozyten führen. Visuell kann dies an fadenziehendem Gewebe beobachtet werden, das nach dem Zerkleinern übrig bleibt, und sichtbaren Klumpen in der Kollagenaselösung. Darüber hinaus führen übermäßiges Zerkleinern und Überverdauen aufgrund des Platzens der reifen Adipozyten zu einem geringen Ertrag. Visuell führt dies zum Verlust der weißen opaken Schicht und zu einer Ansammlung einer großen, klaren, freien Lipidschicht. Ein unangemessenes Maß an Zerkleinerung oder Verdauung führt zu einer schlechten Isolierung der Adipozyten.
Die richtige Vorbereitung und Verdauung des Fettgewebes führt zur Trennung des Gewebes in vier verschiedene Schichten, wie in Abbildung 3 zu sehen ist. Ein gewisses Platzen der Adipozyten, das zur Freisetzung von freien Lipiden führt, ist unvermeidlich; Das richtige Zerkleinern und Verdauen sorgt jedoch für einen minimalen Adipozytenruptur. Die verbleibende freie Lipidschicht und das Medium werden während der Packung der Adipozyten entfernt (Abbildung 4). Die richtige Packung der Adipozyten ist essentiell für die effiziente Isolierung reifer Adipozyten. Verbleibende freie Lipide oder Medien führen zu einer schlechten Isolierung und wirken sich negativ auf nachgelagerte funktionelle Assays wie Plating, Lipolyse und Zellbildgebung aus.
Dieses Protokoll erzeugt eine saubere Aufbereitung reifer Adipozyten. Zellbildgebung und Lipolyse-Assays können durchgeführt werden, um die zelluläre Funktion zu beurteilen und zu zeigen, dass die reifen Adipozyten nach der Isolierung und nach der Kultivierung bis zu zwei Wochen lang funktionieren. Der Lipolyse-Assay zeigt, dass die reifen Adipozyten die Fähigkeit behalten, auf zelluläre Signale durch die Freisetzung von freiem Glycerin nach Stimulation des β-3-adrenergen Rezeptors zu reagieren (Abbildung 6A,B). Diese Fähigkeit bleibt auch nach 2 Wochen in Kultur erhalten und ist sehr vergleichbar mit der Lipolyseaktivität von Fettgewebeexplantaten, die 24 h lang kultiviert wurden (Abbildung 6C,D). Adipozyten von schlechter Qualität zeigen eine abgeschwächte Lipolyse. Die Zellbildgebung von isolierten Adipozyten zeigt runde und intakte unilokuläre reife Adipozyten, die ein einzelnes großes Lipidtröpfchen enthalten. Adipozytenisolierungen von schlechter Qualität zeigen hauptsächlich große, extrazelluläre Öltröpfchen, die auf geplatzte Adipozyten hinweisen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67846/67846fig01.jpg"> 
Abbildung 1: Einbettung von Explantaten aus Fettgewebe. (A) Bild einer teilverfestigten Basalmembran-Matrixkuppel vor der Einbettung des Gewebes. (B) Repräsentative Bilder von unsachgemäßer und ordnungsgemäßer Gewebeeinbettung. Eine unsachgemäße Einbettung ist sichtbar, da das Gewebe teilweise oder vollständig über der Kuppel zu schweben scheint. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67846/67846fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67846/67846fig02.jpg"> 
Abbildung 2: Schema der richtigen Zerkleinerung und Verdauung von Fettgewebe. (A) Schematische Darstellung der Gewebezerkleinerung und der Verdauungsschritte 4.2-4.6. (B) Repräsentative Bilder von unter-, optimalem und überminziertem Gewebe. Unterhacktes Gewebe hat große Stücke, die ihre ursprüngliche Form behalten. Übermäßig zerkleinertes Gewebe führt zu einer sichtbaren Zunahme der freien Lipide, die das Gewebe umgeben, die klar und ölig erscheinen. (C) Repräsentative Bilder von unter-, optimalem und überverdautem Gewebe. Unterverdautes Gewebe enthält Stücke des gesamten Gewebes, die in der Lösung verbleiben. Überverdautes Gewebe weist eine große freie Lipidschicht auf, die sich schnell von der Lösung trennt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67846/67846fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67846/67846fig03.jpg"> 
Abbildung 3: Trennung der Schichten des verdauten Fettgewebes. (A) Schematische und repräsentative Darstellung der Schichten, die nach Schritt 5.3 vorhanden sind. (B) Verwendung einer abgeschnittenen Pipettenspitze, um die reife Adipozytenschicht aus dem konischen 50-ml-Röhrchen zu entfernen. (C) Richtige Technik und Platzierung der Nadel und der Spritze, um das Nährmedium unterhalb der reifen Adipozytenschicht zu entfernen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67846/67846fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67846/67846fig04.jpg"> 
Abbildung 4: Sequentielle Packung reifer Adipozyten. Sequenzielle Bilder von der Verpackung der reifen Adipozyten. Schichten aus freien Lipiden, Adipozyten und Medien werden markiert. Nach jedem Spin werden freie Lipide und Medien entfernt. Dies wird so lange wiederholt, bis sich nach einer Drehung kein Medium oder keine freien Lipide mehr von den Adipozyten trennen. Das endgültige Bild ist repräsentativ für gut gepackte reife Adipozyten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67846/67846fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67846/67846fig05.jpg"> 
Abbildung 5: Plattierung und Kultivierung reifer Adipozyten. (A) Schema der Plattierung reifer Adipozyten. Mit einer abgeschnittenen p200-Pipettenspitze werden gepackte Adipozyten auf die Membran eines Zellkultureinsatzes aufgebracht. Der Einsatz wird dann in vorgefüllte Vertiefungen mit Nährmedien invertiert. (B) Ein repräsentatives Bild der Beschichtung reifer Adipozyten, das eine abgeschnittene Pipettenspitze darstellt, die Adipozyten auf dem Transwell-Insert ablagert. (C) Schematische und repräsentative Bilder von ordnungsgemäß und schlecht gepackten Adipozyten, die mit Transwells beschichtet sind, von oben aus gesehen. Richtig gepackte Adipozyten erscheinen weiß und undurchsichtig, während schlecht gepackte Adipozyten zur Bildung klarer Lipidtröpfchen führen. (D) Schematische Darstellung der Technik zum Wechseln von Kulturmedien. Mit einer Pipettenspitze p200 wird das Medium vorsichtig durch die Öffnungen in der Seitenwand des Transwell-Einsatzes entnommen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67846/67846fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67846/67846fig06.jpg"> 
Abbildung 6: Bildgebung reifer Adipozyten und Lipolyse-Assay. (A,B) Glycerinfreisetzung aus subkutanen (A) und viszeralen (B) reifen Adipozyten. Adipozyten wurden von 16 Wochen alten männlichen C57BL/6-Mäusen isoliert, die mit normaler Futternahrung gefüttert wurden. 30 μl Adipozyten wurden wie in Schritt 7.1 beschrieben plattiert und 1 oder 10 Tage lang kultiviert. Die Adipozyten wurden mit 5 μM CL-316,243 für 1 h, 2 h und 4 h behandelt, und Überstände wurden gesammelt und auf freies Glycerin analysiert. (C,D) Glycerinfreisetzung aus subkutanen (C) und viszeralen (D) Fettgewebexplantaten. Fettgewebe wurde von 18 Wochen alten weiblichen Mäusen mit C57BL/6 isoliert, die mit normalem Futter gefüttert wurden. 0,1 g Fettgewebeexplantate wurden wie in den Schritten 3.1-3.4 beschrieben plattiert und 24 h lang kultiviert. Die Adipozyten wurden mit 5 μM CL-316,243 für 1 h, 2 h und 4 h behandelt, und Überstände wurden gesammelt und auf freies Glycerin analysiert. N = 3 technische Repliken für A-D. Alle Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung. (E) Repräsentative Bilder von isolierten subkutanen und viszeralen reifen Adipozyten. Adipozyten wurden von 16 Wochen alten männlichen C57BL/6J-Mäusen isoliert, die mit normaler Futternahrung gefüttert wurden. Die Adipozyten wurden mit der Plasmamembranfärbung (rot) und der Hoechst-Zellkernfärbung (blau) gefärbt. Maßstabsleisten: 50 μm; Vergrößerung: 60x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67846/67846fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sex</td>
			<td>Diät</td>
			<td>Depot</td>
			<td>Schwierigkeit beim Hacken</td>
			<td>Kollagenase: Verhältnis von Gewebe</td>
			<td>Empfohlene Aufschlusszeit (min)</td>
			<td>Schleudertemp.</td>
			<td>Waschtemperatur.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">Weiblich</td>
			<td rowspan="2">Normales Chow</td>
			<td>Subkutan</td>
			<td>Hart</td>
			<td>2:1</td>
			<td>12</td>
			<td>RT</td>
			<td>37 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viszeral</td>
			<td>Mittel</td>
			<td>1:1</td>
			<td>8</td>
			<td>RT</td>
			<td>37 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Fettreiche Ernährung</td>
			<td>Subkutan</td>
			<td>Leicht</td>
			<td>1:1</td>
			<td>8</td>
			<td>RT</td>
			<td>37 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viszeral</td>
			<td>Leicht</td>
			<td>1:1</td>
			<td>8</td>
			<td>RT</td>
			<td>37 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">Männlich</td>
			<td rowspan="2">Normales Chow</td>
			<td>Subkutan</td>
			<td>Hart</td>
			<td>2:1</td>
			<td>14</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viszeral</td>
			<td>Mittel</td>
			<td>1:1</td>
			<td>10</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Fettreiche Ernährung</td>
			<td>Subkutan</td>
			<td>Leicht</td>
			<td>1:1</td>
			<td>10</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viszeral</td>
			<td>Leicht</td>
			<td>1:1</td>
			<td>10</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 1: Geschlechts-, Depot- und ernährungsspezifische Modifikationen. Die Zerkleinerungsschwierigkeit jedes Gewebes, die im Verhältnis zu anderen Depots als "leicht", "mittel" oder "hart" beschrieben wird. Beachten Sie, dass die tatsächliche Zerkleinerungszeit je nach Forscher und Gewebe variieren kann. Kollagenase: Gewebeverhältnis angegeben als Volumen (ml) der in Schritt 4.1 hergestellten Kollagenase + DNase-Lösung zum Gewicht des Gewebes (g). Die Verdauungszeit ist eine ungefähre Schätzung, aber die tatsächliche Verdauungszeit variiert je nach Zerkleinerung und Gewebe. Die Forscher sollten die Verdauung wie im Protokoll beschrieben beurteilen. Die Schleudertemperatur und die Waschtemperatur unterscheiden sich zwischen männlichen und weiblichen Mäusen. RT bezeichnet die Raumtemperatur.

Isolierung und Kultivierung von primären murinen Adipozyten aus mageren und adipösen Mäusen

Adipose tissue is primarily composed of mature, lipid-laden adipocytes by volume. These postmitotic cells play a critical role in energy storage and ...

Unsere Forschung konzentriert sich auf die Untersuchung der Funktion reifer Adipozyten aus verschiedenen Fettdepots und Ernährungsbedingungen. Wir sind insbesondere daran interessiert zu verstehen, wie reife Adipozyten mit umgebenden Zellen kommunizieren und wie diese Wechselwirkung das Fortschreiten der Krankheit beeinflussen und bei Fettleibigkeit verändert werden kann. Reife Adipozyten sind große und empfindliche Zellen, was die häufig verwendeten Zellisolationsmethoden wie FACS unwirksam macht.Darüber hinaus können hohe Konzentrationen an freien Lipiden, die häufig im Fettgewebe vorkommen, für reife Adipozyten giftig sein und ihre Erhaltung erschweren. Im Gegensatz zu häufig verwendeten Methoden, die auf der in vitro Differenzierung von Präadipozyten beruhen, ermöglicht uns dieses Protokoll, ex vivo isolierte Adipozyten zu untersuchen, die funktionell und transkriptionell wie in vivo Adipozyten sind. Dies ist besonders wichtig, da Adipozyten zwischen Fettdepots und unter verschiedenen Ernährungsbedingungen stark variieren.Dieses Protokoll isoliert effizient und spiegelt reife Adipozyten und ist leicht skalierbar. Es sind Anpassungen enthalten, um die Isolierung von Adipozyten von Mäusen unterschiedlichen Geschlechts und mit unterschiedlichen Ernährungsbedingungen zu optimieren. Nach der Isolierung können die Adipozyten je nach Bedarf kultiviert, abgebildet oder anderweitig verwendet werden.Bereiten Sie zunächst eine Kollagenaselösung mit DNase vor, indem Sie 0,00017 Gramm DNase pro einem Milliliter Kollagenaselösung hinzufügen und die Mischung wirbeln, um eine vollständige Durchmischung zu gewährleisten. Mit einer Rasierklinge das isolierte Fettgewebe der Mäuse zerkleinern, bis es homogen erscheint. Anschließend geben Sie das Hackfleisch in ein steriles konisches 50-Milliliter-Röhrchen.Geben Sie die vorbereitete Kollagenase und DNase-Lösung in das gehackte Fettgewebe und wirbeln Sie sie sieben bis 10 Sekunden lang bei maximaler Geschwindigkeit, um die Komponenten gründlich zu mischen. Legen Sie dann die konischen 50-Milliliter-Röhrchen für 10 Minuten horizontal in einen auf 220 U/min bei 37 Grad Celsius eingestellten Shaker. Nach der Inkubation die Röhrchen entfernen, fünf Sekunden lang wirbeln und die Proben überprüfen.Nun wird das verdaute Gewebe mit einer serologischen Pipette durch ein Sieb in ein neues, steriles konisches 50-Milliliter-Röhrchen geleitet. Geben Sie FBS in Höhe des Gewebevolumens und der Kollagenaselösung durch das Sieb in dasselbe konische Röhrchen, um die Kollagenase zu neutralisieren. Schleudern Sie die Röhrchen drei Minuten lang bei 300 g bei der in der hier gezeigten Tabelle angegebenen Temperatur.Entsorgen Sie dann mit einer 200-Mikroliter-Pipette vorsichtig die oberste Schicht der freien Lipide. Verwenden Sie anschließend eine P1000-Pipette mit abgeschnittener Spitze, um die reifen Adipozyten in ein vorbereitetes 15-Milliliter-Röhrchen mit 10 Millilitern Wachstumsmedium zu übertragen. Drehen Sie die 15-Milliliter-Röhrchen mit reifen Adipozyten drei- bis fünfmal vorsichtig um, bis sich die weiße Schicht im Medium verteilt.Nachdem Sie die Röhren 10 Minuten ruhen gelassen haben, drehen Sie sie bei der zuvor festgelegten Temperatur, um die Schichten weiter zu trennen. Verwenden Sie danach eine Pipette, um die oberste Schicht der freien Lipide zu entsorgen. Befestigen Sie nun eine 21-Gauge-Nadel an einer Fünf-Milliliter-Spritze und schieben Sie die Nadel vorsichtig am Rand des Röhrchens hinunter, bis sich die Unterseite der Nadel unter der Schicht an der Stelle der reifen Adipozyten befindet.Ziehen Sie dann die Spritze langsam nach oben, um das Nährmedium und alle Zelltrümmer zu entfernen. Geben Sie vorsichtig 10 Milliliter Nährmedium in das Röhrchen. Verwenden von Pipettenspitzen mit Gelladefunktion Schieben Sie die Spitze am Rand des Röhrchens nach unten, um das restliche Medium unter der reifen Adipozytenschicht zu entfernen.Dann zentrifugieren Sie die Zellen eine Minute lang bei 100 g. Mit einer Pipette die freien Lipide entfernen. Entfernen Sie mit einer Pipettenspitze zum Laden des Gels das Nährmedium unter den Adipozyten.Entnehmen Sie die Zellkultureinsätze von einer mit Gewebekulturen behandelten 24-Well-Platte und legen Sie sie mit der Membranseite nach oben auf die Oberfläche der Haube. Füllen Sie die abwechselnden Vertiefungen der Platte mit warmen Nährmedien. Übertragen Sie mit einer geschnittenen P200-Pipettenspitze 30 Mikroliter gepackter reifer Adipozyten auf die Oberseite eines Transwell-Einsatzes.Nehmen Sie dann vorsichtig den Transwell-Einsatz auf, drehen Sie ihn um und legen Sie ihn in eine vorgefüllte Vertiefung in der 24-Well-Platte. Um das Medium aus den Vertiefungen zu entfernen, halten Sie den Transwell-Einsatz ruhig und saugen Sie mit einer P200-Pipette durch die kleinen Öffnungen an den Seiten. Nachdem Sie das Medium entfernt haben, während Sie den Transwell immer noch an Ort und Stelle halten, fügen Sie langsam einen Milliliter frisches Medium entlang der Seitenwand des Wells hinzu.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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