Name: Nutzung von Virtual Reality für die immersive Segmentierung und Analyse von Kryo-Elektronentomographie-Daten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Lernen Sie die Segmentierung von Kryo-Elektronentomographie-Daten mit Virtual Reality für die Analyse zellulärer Ultrastrukturen in Säugetierzellen. Diese Methode steigert die Effizienz und Präzision bei der 3D-Rekonstruktion.

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<meta charset="utf8"></head><body>VR-Interaktionswerkzeuge: 3D-Kryo-ET-Datensegmentierung

<ol><li>Plitzko, J. M., Schuler, B., Selenko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+biology+outside+the+box-inside+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural biology outside the box-inside the cell.</a> Curr Opin Struct Biol. 46, 110-121 (2017).</li>
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<li>Tegunov, D., Xue, L., Dienemann, C., Cramer, P., Mahamid, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-particle+cryo-EM+refinement+with+M+visualizes+ribosome-antibiotic+complex+at+3.5+%C3%85+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Multi-particle cryo-EM refinement with M visualizes ribosome-antibiotic complex at 3.5 Å in cells.</a> Nat Methods. 18 (2), 186-193 (2021).</li>
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<li>Barad, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+organellar+ultrastructure+in+cryo-electron+tomography+using+a+surface+morphometrics+pipeline%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantifying organellar ultrastructure in cryo-electron tomography using a surface morphometrics pipeline.</a> J Cell Biol. 222 (2), e202204093(2023).</li>
<li>Martinez-Sanchez, A., Garcia, I., Asano, S., Lucic, V., Fernandez, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+membrane+detection+based+on+tensor+voting+for+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Robust membrane detection based on tensor voting for electron tomography.</a> J Struct Biol. 186 (1), 49-61 (2014).</li>
<li>Heebner, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+learning-based+segmentation+of+cryo-electron+tomograms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Deep learning-based segmentation of cryo-electron tomograms.</a> J Vis Exp. (189), e64435(2022).</li>
<li>Garza-López, E., Robles-Flores, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+generating+surfaces+and+measuring+3D+organelle+morphology+using+Amira%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Protocols for generating surfaces and measuring 3D organelle morphology using Amira.</a> Cells. 11 (1), 65(2021).</li>
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<li>Pidhorskyi, S., Morehead, M., Jones, Q., Spirou, G., Doretto, G. syGlass: interactive exploration of multidimensional images using virtual reality head-mounted displays. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPidhorskyi%2C+S+%22arXiv%22">arXiv</a>. , (2018).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Tegunov, D., Cramer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+cryo-electron+microscopy+data+preprocessing+with+Warp%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp.</a> Nat Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).</li>
<li>Bepler, T., Kelley, K., Noble, A. J., Berger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topaz-Denoise%3A+general+deep+denoising+models+for+cryoEM+and+cryoET%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Topaz-Denoise: general deep denoising models for cryoEM and cryoET.</a> Nat Commun. 11, 5208(2020).</li>
<li>Buchholz, T. -O., Berninger, L., Maurer, M., Jug, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-CARE%3A+content-aware+image+restoration+for+cryo-transmission+electron+microscopy+data%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+IEEE+Int+Symp+Biomed+Imaging%22%5BJournal%5D)">Cryo-CARE: content-aware image restoration for cryo-transmission electron microscopy data.</a> Proc IEEE Int Symp Biomed Imaging. 16, 502-506 (2019).</li>
<li>Buchholz, T. -O., Jordan, M., Pigino, G., Jug, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Content-aware+image+restoration+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Content-aware image restoration for electron microscopy.</a> Methods Cell Biol. 152, 277-289 (2019).</li>
<li>Liu, Y. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotropic+reconstruction+for+electron+tomography+with+deep+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Isotropic reconstruction for electron tomography with deep learning.</a> Nat Commun. 13, 6482(2022).</li>
<li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> J Struct Biol. 116 (1), 71-76 (1996).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>CryoET-Datenformat</td><td></td><td></td><td>:TIFF-Stack, TIFF</td></tr><tr><td>HTC VIVE Cosmos</td><td>HTC</td><td>99HARL000-00</td><td>https://www.vive.com/sea/product/vive-cosmos/features/</td></tr> <tr><td>Intel(R) Core(TM) i7-10870H CPU @ 2,20 GHz 2,21 GHz</td><td>Intel</td><td></td><td>https://ark.intel.com/content/www/us/en/ark/products/208018/intel-core-i7-10870h-processor-16m-cache-up-to-5-00-ghz.html</td></tr><tr><td>NVIDIA GeForce RTX 3070 Laptop GPU</td><td>NVIDIA</td><td></td><td>https://www.nvidia.com/en-us/geforce/laptops/compare/30-series/</td></tr> <tr><td>syGlass Software</td><td>syGlass</td><td></td><td>syGlass Software installiert auf einem kompatiblen Windows-PC</td></tr><tr><td>VIVE Cosmos Hand Controller</td><td>HTC</td><td>99HAFR001-00</td><td>https://www.vive.com/us/accessory/cosmos-controller-right/</td></tr> <tr><td>Windows 11 Home</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Microsoft Windows 11 Startseite</td></tr></tbody></table>

nutzung von virtual reality für die immersive segmentierung und analyse von kryo-elektronentomographie-daten

Leveraging Virtual Reality for Immersive Segmentation and Analysis of Cryo-Electron Tomography Data

In dieser Studie segmentierten wir Tomogramme, die Mitochondrien und zusätzliche membranöse Organellen (z.B. Vesikel, endoplasmatisches Retikulum) enthielten, mit syGlass. Die Tomogramme wurden zunächst in Warp mittels Weighted-Back-Projektion bei 16.00 Å/Pixel rekonstruiert und mit der Software IsoNet einer fehlenden Keilkorrektur und Rauschunterdrückung unterzogen. Die folgenden Tomogramme wurden für den Import einer zusätzlichen Verarbeitung unterzogen, wie in Abbildung 1A gezeigt (siehe auch Ergänzendes Video S1, Ergänzendes Video S2, Ergänzendes Video S3 und Ergänzendes Video S4).
Nach der Vorverarbeitung wurden Tomogramme im MRC-Format mit ImageJ in TIFF-Stacks konvertiert, wobei die Kontrastinversion angewendet wurde, um die Membranen auf schwarzem Hintergrund weiß erscheinen zu lassen. Anschließend wurde eine Histogramm-Entzerrung durchgeführt, um den Kontrast weiter zu verbessern. Dies ermöglicht auch eine effektivere Festlegung von Schwellenwerten. Die TIFF-Stacks wurden importiert und in 3D in einer immersiven VR-Umgebung visualisiert, um eine detaillierte Inspektion membranöser Strukturen mit dem Cut-Tool in der in Abbildung 1B gezeigten Software zu ermöglichen.
In der Software wurde eine manuelle Segmentierung durchgeführt, wobei die Fensterfunktion auf "Auto" eingestellt wurde und Helligkeits-/Schwellenwertanpassungen vorgenommen wurden, um die Sichtbarkeit der Mobilfunkfunktionen zu optimieren. ROIs um Mitochondrien und andere Strukturen wurden mit Hilfe der VR-Controller definiert. Das Segmentierungswerkzeug ermöglichte eine präzise Abgrenzung der Membrangrenzen, wobei Fehler mit der Löschfunktion korrigiert wurden. Die Schicht-für-Schicht-Navigation oder in 3D mit dem ROI-Tool zum Einrahmen von Regionen im gesamten Tomogramm in Kombination mit dem einstellbaren Pinselwerkzeug gewährleistete eine genaue Segmentierung der Mitochondrienmembranen und anderer Organellen, wie in Abbildung 1C gezeigt.
Die segmentierten Daten wurden visualisiert, indem ein Netz mit der Oberflächenoption des ROI-Werkzeugs generiert wurde, wobei die Glättungsiterationen auf 12 und die Auflösungsstufe auf 3 festgelegt waren. Die endgültigen 3D-Renderings zeigen deutlich die mitochondrialen Strukturen, einschließlich der äußeren und inneren Membranen, Crista und Calciumphosphatablagerungen, wie in Abbildung 1D gezeigt (siehe auch Ergänzendes Video S5, Ergänzendes Video S6, Ergänzendes Video S7 und Ergänzendes Video S8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67849/67849fig01.jpg"> 
Abbildung 1: Arbeitsablauf der Tomogramm-Visualisierung, Segmentierung und 3D-Rendering mit Syglass. (A) Tomographische Schnitte von RPE1-Zellen mit dünnen Kanten. IsoNet-korrigierte Tomogramme, die in Warp rekonstruiert und für die Segmentierung mit syGlass verwendet wurden, visualisiert mit IMOD25. Die Tomogramme wurden an einem 300 keV Titan-Krios-Mikroskop gesammelt, das mit einem K3-Detektor ausgestattet war, und auf die dünnen Ränder von retinalen Epithelzellen fokussiert. Jedes Tomogramm enthält mindestens ein Mitochondrium zusammen mit verschiedenen anderen membrangebundenen Organellen. Bei diesen Bildern handelt es sich um Standbilder von Videos, die in Ergänzendes Video S1, Ergänzendes Video S2, Ergänzendes Video S3 und Ergänzendes Video S4 gezeigt werden. (B) Entsprechende Tomogramme, die in der Software visualisiert werden. Tomographische Schnitte, die mit dem Schnittwerkzeug in der VR-Software erstellt wurden, nachdem Schwellenwerte, Helligkeit und Fensterbildung optimiert wurden, wodurch unterschiedliche zelluläre Strukturen sichtbar wurden. (C) Tomogramme, die in der Software mit segmentierten Membranen visualisiert werden. Tomographische Schnitte, die mit dem Schnittwerkzeug in der VR-Software erstellt und mit der entsprechenden Segmentierung überlagert wurden. Calciumphosphatablagerungen sind gelb, Mitochondrienmembranen in Cyan und andere Membranen wie Vesikel und die Plasmamembran violett dargestellt. (D) 3D-Rendering der segmentierten Membranen in syGlass. Die Mitochondrienmembranen, einschließlich der Cristae, der äußeren und inneren Mitochondrienmembranen, sind in Cyan dargestellt. Calciumphosphatablagerungen sind gelb oder grün, Vesikel und die Plasmamembran sind violett und das endoplasmatische Retikulum ist hellbraun. Bei diesen Bildern handelt es sich um Standbilder von Videos, die in "Ergänzende Videos S5", "Ergänzende Videos S6", "Ergänzende Videos S7" und "Ergänzende Videos S8" gezeigt werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67849/67849fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzendes Video S1: Tomogramm der Probe RPE-1_1, die für die Segmentierung in dieser Studie verwendet wurde. Dieses Tomogramm wird mit 16 Å/Pixel mittels Warp rekonstruiert, dann entrauscht und mit IsoNet um das fehlende Wedge korrigiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67849/67849_SuppFile1a-Edward-Eng.avi" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzendes Video S2: Tomogramm der Probe RPE-1_2, die für die Segmentierung in dieser Studie verwendet wurde. Dieses Tomogramm wird mit 16 Å/Pixel mittels Warp rekonstruiert, dann entrauscht und mit IsoNet um das fehlende Wedge korrigiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67849/67849_SuppFile1b-Edward-Eng.avi" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzendes Video S3: Tomogramm der Probe RPE-1_3, die für die Segmentierung in dieser Studie verwendet wurde. Dieses Tomogramm wird mit 16 Å/Pixel mittels Warp rekonstruiert, dann entrauscht und mit IsoNet um das fehlende Wedge korrigiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67849/67849_SuppFile1c-Edward-Eng.avi" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzendes Video S4: Tomogramm der Probe RPE-1_4, die für die Segmentierung in dieser Studie verwendet wurde. Dieses Tomogramm wird mit 16 Å/Pixel mittels Warp rekonstruiert, dann entrauscht und mit IsoNet um das fehlende Wedge korrigiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67849/67849_SuppFile1d-Edward-Eng.avi" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzendes Video S5: Die resultierende Segmentierung des Beispiels RPE-1_1 nach der Generierung von Oberflächen. Die mitochondrialen Membranen sind in Cyan dargestellt; Kalziumphosphate in den Mitochondrien sind gelb dargestellt; Das endoplasmatische Retikulum ist in Tan dargestellt; und andere Membranen werden violett dargestellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67849/67849_SuppFile2a-Edward-Eng.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzendes Video S6: Die resultierende Segmentierung des Beispiels RPE-1_2 nach der Generierung von Oberflächen. Die mitochondrialen Membranen sind in Cyan dargestellt; Kalziumphosphate in den Mitochondrien sind gelb dargestellt; Das endoplasmatische Retikulum ist in Tan dargestellt; und andere Membranen werden violett dargestellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67849/67849_SuppFile2b-Edward-Eng.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzendes Video S7: Die resultierende Segmentierung der Probe RPE-1_3 nach der Generierung von Oberflächen. Die mitochondrialen Membranen sind in Cyan dargestellt; Kalziumphosphate in den Mitochondrien sind gelb dargestellt; Das endoplasmatische Retikulum ist in Tan dargestellt; und andere Membranen werden violett dargestellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67849/67849_SuppFile2c-Edward-Eng.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzendes Video S8: Die resultierende Segmentierung von Sample RPE-1_4 nach der Generierung von Oberflächen. Die mitochondrialen Membranen sind in Cyan dargestellt; Kalziumphosphate in den Mitochondrien sind gelb dargestellt; Das endoplasmatische Retikulum ist in Tan dargestellt; und andere Membranen werden violett dargestellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67849/67849_SuppFile2d-Edward-Eng.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Nutzung von Virtual Reality für die immersive Segmentierung und Analyse von Kryo-Elektronentomographie-Daten

Cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technique for visualizing the ultrastructure of cells in three dimensions (3D) at nanometer resolution. ...

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Der Engpass für Mobil 3D-Elektronenmikroskopie ist die Merkmalsextraktion (Segmentierung) in hochkomplexen 3D-Dichtekarten. Wir haben eine Reihe von Kriterien, die den Orientierungsrahmen in Bezug auf die Segmentierungsansatz (manuell, halbautomatisch oder automatisch) ist am besten geeignet für verschiedene Datentypen entwickelt, so dass ein Ausgangspunkt für eine effektive Segmentierung.

Von Voxel zu Wissen: ein praktischer Leitfaden für die Segmentierung der Elektronenmikroskopie Komplexe 3D-Daten

Die beschriebene Pipeline ist für die Segmentierung von Elektronenmikroskopie-Datensätzen größer als Gigabyte konzipiert, um Ganzzellmorphologien zu extrahieren. Sobald die Zellen in 3D rekonstruiert sind, kann kundenspezifische Software, die auf individuelle Bedürfnisse zugeschnitten ist, verwendet werden, um eine qualitative und quantitative Analyse direkt in 3D durchzuführen, auch mit virtueller Realität, um Die Sichtokklusion zu überwinden.

Eine Methode zur 3D-Rekonstruktion und Virtual Reality-Analyse von Glia- und Neuronalzellen

Fokussiertes Ionenstrahlfräsen zur Herstellung von glasartigen On-Grid-Lamellen aus tiefgefrorenen biologischen Proben für die Kryo-Elektronentomographie.

Präparation von Lamellen aus glasartigen biologischen Proben mit einem Zweistrahl-Rasterelektronenmikroskop für die Kryo-Elektronentomographie

Die steigende Nachfrage nach großflächiger Datenerfassung in der kryogenen Elektronentomographie erfordert Bilderfassungsroutinen mit hohem Durchsatz. Hier wird ein Protokoll beschrieben, das die jüngsten Entwicklungen fortschrittlicher Akquisitionsstrategien implementiert, die darauf abzielen, die Zeiteffizienz und den Durchsatz der tomographischen Datenerfassung zu maximieren.

Strategien zur Optimierung der Datenerfassung in der Kryoelektronentomographie

Das vorliegende Protokoll beschreibt die hochauflösende Kryo-Elektronentomographie-Ferndatenerfassung mit Tomo5 und die anschließende Datenverarbeitung und Subtomogramm-Mittelung mittels emClarity. Apoferritin wird als Beispiel verwendet, um detaillierte Schritt-für-Schritt-Prozesse zu veranschaulichen, um eine Kryo-ET-Struktur bei 2,86 Å Auflösung zu erreichen.

Kryo-Elektronen-Tomographie Ferndatenerfassung und Subtomogramm-Mittelwertbildung

Hierbei handelt es sich um ein Verfahren zum Trainieren eines Mehrschicht-U-Netzes für die Mehrklassensegmentierung von Kryo-Elektronen-Tomogrammen, wobei ein Teil eines Tomogramms als Trainingseingabe verwendet wird. Wir beschreiben, wie man dieses Netzwerk auf andere Tomogramme ableiten kann und wie man Segmentierungen für weitere Analysen extrahiert, wie z.B. Subtomogramm-Mittelung und Filament-Tracing.

Deep-Learning-basierte Segmentierung von Kryo-Elektronen-Tomogrammen

Die Kryo-STEM-Tomographie bietet eine Möglichkeit, Organellen intakter Zellen ohne Einbettung, Schnitt oder andere invasive Präparate sichtbar zu machen. Die erzielte 3D-Auflösung liegt derzeit im Bereich von wenigen Nanometern, mit einem Sichtfeld von mehreren Mikrometern und einer zugänglichen Dicke in der Größenordnung von 1 μm.

Visualisierung von Organellen in situ mittels Kryo-STEM-Tomographie

Dieses Protokoll standardisiert die Kryo-Elektronen-Tomographie (Kryo-ET) für dickes Gewebe, indem es Hochdruck-Gefrieren (HPF) mit der Waffelmethode, kryogenen Fokusionenstrahl (Cryo-FIB) Lift-out und dosissymmetrische, parallele Aufnahme integriert, wodurch gleichmäßig dünne Lamellen und vitrifizierte Proben für eine reproduzierbare In-situ-Analyse im Maus-Hippocampus entstehen.

Kryo-Elektronen-Tomographie-Workflow für dickes Gewebe demonstriert im Maus-Hippocampus

Dieser Artikel beschreibt ein neuartiges Protokoll und Reagenz-Set für empfindliche Messung der neurotoxischen Wirkungen von Verbindungen und Behandlungen auf Co-Kulturen von Neuronen und Astrozyten mit High Content Analyse entwickelt. Die Ergebnisse zeigen, dass High Content Analyse eine spannende neue Technologie für die Neurotoxizität Beurteilung darstellt.

Eine Neuronale und Astrocyte Co-Kultur-Assay für High Content Analyse der Neurotoxizität

Das Project on Virtual Reality Intelligent Multi-Sensor-System für die Behandlung von Angst-Erkrankungen (Intrepid) ist auf die Entwicklung eines Multi-Sensor-kontextsensitive Virtual-Reality-System für die Behandlung von Angst-Erkrankungen ausgerichtet.

Der Einsatz von Biofeedback in der klinischen Virtual Reality: Die INTREPID Projekt

Lernen Sie die Segmentierung von Kryo-Elektronentomographie-Daten mit Virtual Reality für die Analyse zellulärer Ultrastrukturen in Säugetierzellen. Diese Methode steigert die Effizienz und Präzision bei der 3D-Rekonstruktion.

Nutzung von Virtual Reality für die immersive Segmentierung und Analyse von Kryo-Elektronentomographie-Daten

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