Live-Zell-Imaging mit Zeitrafferfotografie zur Untersuchung der Proliferationskinetik der epidermalen Keratinozyten

Diese Forschung konzentriert sich auf hyper- und hypoproliferative Erkrankungen wie Psoriasis und Alterung, mit Schwerpunkt darauf, wie diese Erkrankungen die Proliferation von Stammzellen und Vorläuferzellen beeinflussen. Die Identifizierung der spezifischen Stellen proliferativer Defekte ermöglicht die Entwicklung präziserer, gezielter Therapien. Für die menschliche Epidermis hatten wir keine Techniken, die es ermöglichen, bestimmte Vorfahren über mehrere Generationen hinweg zu verfolgen.

Schließlich ermöglicht die Live-Zell-Bildgebung es uns, einem engagierten Vorläufer in vitro über mehrere Generationen hinweg zu folgen, und hat viele Einblicke in das menschliche Verhalten von bestimmten Vorläufern geliefert. Wir haben mit lebender Zellbildgebung gezeigt, dass wir zwar wissen, dass Stammzellen sich seltener teilen als feste Vorläufer, aber wenn sie sich teilen, sich schneller teilen. Wenn Gewebeschäden auftreten, können Stammzellen durch eine schnelle Veränderung reagieren.

Zu Beginn entnehmen Sie Keratinozyten aus frischer menschlicher Haut. Bestimmen Sie die geeignete Saatdichte für den Test und führen Sie Pilotstudien mit Proben mit mehrfacher Verdünnung verschiedener Spender durch. Um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu erreichen, wird das gesamte für alle Bohrungen benötigte Medium bei einer bestimmten Verdünnung in ein Mikrorohr verdünnt.

Pipettieren Sie die Gesamtzahl der benötigten Zellen, um die gewünschte Dichte zu erreichen, in den Aliquot und wenden Sie die Mikroröhre vorsichtig um, um die Zellen homogen zu verteilen. Jetzt fügen Sie die Federung auf die Platten hinzu. Nach dem Anrichten bewegt man die Platte in einem Kreuzmuster dreimal nach oben, runter, dann nach links, rechts und überträgt die Platte vorsichtig in den Inkubator.

Nach der Inkubation das Medium wechseln. Um den Brutkasten des Bildgebungssystems zu öffnen, drücken Sie den großen dreieckigen Knopf unten links. Wenn die Ampel grün wird, platziere das Gefäß in einen offenen Bereich und schließe das Tablett mit demselben Knopf.

Öffnen Sie nun die Anwendung auf dem Computer und melden Sie sich mit der entsprechenden Benutzeridentifikation und dem Passwort an. Dann wählen Sie Terminplanung. Drücke den Plus-Button unter dem Zeitplan, um die Platte zum Zeitplan hinzuzufügen.

Wählen Sie Scannen auf Zeitplan und klicken Sie dann auf Nächste. Dann wählen Sie Neu und wählen Sie Standard für Scan-Typ. Für Scan-Einstellungen wählen Sie adhärent Zelle für Zelle mit dem Phasenkanal bei 10x Objektiv aus und klicken Sie dann auf Nächsten.

Als Nächstes wählst du das Gefäß und klickst dann auf Nächst. Wählen Sie eine leere Bucht aus, um das Schiff zu platzieren, und klicken Sie auf Nächst. Wählen Sie die zu scannenden Wells sowie die Anzahl der Bilder pro Well, und klicken Sie dann auf Next.

Benennen Sie das Experiment nach der gewünschten Namenskonvention. Erstellen Sie eine Plattekarte des Experiments für die spätere Referenz. Dann klicke auf Okay.

Klicken Sie jetzt auf Weiter, um fortzufahren. Die Analyse auf die Datenerhebung verschieben, da die Zell-für-Zell-Analyse nach dem Scannen eingeleitet werden muss. Klicke nochmal auf Nächsten.

Stellen Sie die Bildfrequenz auf 20-Minuten-Intervalle ein, um die Mitose zuverlässig zu verfolgen, die etwa alle 30 Minuten stattfindet. Drücken Sie auf Next und bestätigen Sie die Einstellungen, um das Experiment zu starten. Wechsle das Keratinozyten alle 48 Stunden.

Um die korrekte Ausrichtung der Platte sicherzustellen, warten Sie jedes Mal, wenn ein Gefäß in die Maschine gesetzt wird, bis der erste Scan abgeschlossen ist. Platzieren Sie die Platte so, dass die Buchstaben, die die Reihen kennzeichnen, auf der linken Seite des Feldes liegen. Folgen Sie erwachsenen Kolonien etwa zwei Wochen lang und neonatalen Kolonien etwa 10 Tage, wobei die Überhöhung die analytische Qualität verringert.

Sobald alle Brunnen ruhig geworden sind oder eine Zusammenfluss erreicht haben, klicken Sie auf den Reiter Ansicht und doppelklicken Sie auf das Experiment unter der Liste der Letzten Betrügereien. Klicke mit dem Pfeil auf das Landschaftssymbol und warte darauf, dass das Export-Tool gestartet wird. Klicken Sie auf Wie angezeigt und dann auf Nächst.

Klicken Sie dann manuell auf jedes Feld von Ansicht zum Exportieren und klicken Sie dann auf Nächst. Wählen Sie aus, ob ein Film oder eine Bildserie gewünscht wird. Für die Nachverfolgung der Keratinozytenlinie wählen Sie die Option Film und alle Scans mit dem Symbol "Alle auswählen" und klicken Sie auf Weiter.

Exportiere mit einem Bild pro Sekunde bei maximaler Qualität, nachdem du die Leiste neben Qualität eingestellt hast. Nachdem Sie den Zielordner und Dateityp ausgewählt haben, benennen Sie die Datei und klicken Sie auf Exportieren. Öffnen Sie die Videodatei mit einem Mediaplayer, scrollen Sie durch die Videos und identifizieren Sie wachsende Kolonien.

Mit VLC machst du einen Screenshot der zu verfolgenden Kolonie und beschrifte sie. Identifizieren Sie eine interessante Kolonie entweder am Ende oder nach einigen Tagen Videoaufnahme. Spulen Sie das Video zurück und identifizieren Sie die Koloniebildungszelle.

Das Video pausieren, wenn die Zelle sich teilt, da sie zu kondensieren scheint. Notiere den Zeitstempel, der unten links angezeigt wird. Mach einen Screenshot der Division und beschrifte sie wie die Kolonie.

Dokumentieren Sie jede Division mit einem handgezeichneten Abstammungsdiagramm. Transkribiere den manuellen Stammbaum in Datenblätter, die aufgrund der Farbe der Tabellenkalkulationen als Grüne Blätter bezeichnet werden. Verwenden Sie schließlich die grünen Blätter, um die Anteile von proliferativen und differenzierenden Divisionen zu berechnen.

Identifizieren Sie Stammzell- und entschlossene Vorläuferkolonien und bestimmen Sie die Zellzyklusdauer. Primäre Keratinozyten zeigten eine stereotype Entwicklung im Aussehen, beginnend als kleine, abgerundete Zellen bei der ersten Aussaatung, dann abgeflacht und beweglich. Sie beginnen vor der Teilung zu kondensieren und bilden proliferative Kolonien oder terminal differenzierte Kolonien mit uneinheitlicher Morphologie.

Sobald das grüne Blatt erstellt ist, kann man feststellen, welche Kolonien von Stammzellen und welche von festgelegten Vorläufern abstammen.