Name: Charakterisierung der pH-abhängigen reversiblen Selbstorganisation von Amyloid-beta-1-40-beschichteten Goldkolloiden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-21T14:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Erfahren Sie die pH-abhängige reversible Selbstorganisation von Amyloid-beta-1-40 auf Goldkolloiden mittels SERS-Spektroskopie. Diese Methode liefert Einblicke in Proteinfaltung und Aggregationsdynamik für Alzheimer-Forschung.

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1. Herstellung von Aβ 1-40 beschichteten Goldnanopartikeln
<ol>
	<li>Mit einer Spritzennadel wird ein Volumen von 1 ml destilliertem deionisiertem Wasser zu 1 mg lyophilisiertem Aβ 1-40 (MW: 4,2 kDa, 98 % HPLC-Reinheit) hinzugefügt. Mischen Sie die Lösung mit einem Wirbelmischer für ca. 30 s und stellen Sie sicher, dass bei Raumtemperatur (RT; ~20 °C) keine festen Partikel in der Lösung beobachtet werden.<ol>
		<li>Bereiten Sie alle Stammlösungen mit deionisiertem und destilliertem Wasser (~18 MΩ·cm) vor.</li>
		<li>Spektroskopische Bestimmung der Konzentration unter Verwendung der Tyrosinabsorption bei 275 nm32, die einen molekularen Extinktionskoeffizienten ε275 von 1390 cm-1· M-1.</li>
		<li>Lagerlösungen von Aβ 1-40 bei -80 °C. (Siehe Materialtabelle für die Handelsprodukte von Aβ 1-40.)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tauen Sie die Peptid-Stammlösung etwa 5 Minuten vor der Datenerfassung auf. Mischen Sie ein Volumen von 8 μl der Peptidlösung mit 800 μl kolloidalen Goldpartikeln in einem 15 mL Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie ein Volumen von 4,2 mL deionisiertem destilliertem Wasser hinzu und wirbeln Sie die Probe dann 10 slang 30,31,33,34 ein.</li>
	<li>Legen Sie die Konzentration von Aβ 1-40 Peptiden auf 1,8 nmol fest und stellen Sie das Verhältnis von Aβ 1-40 Peptiden ein. Die Anzahl der Goldkolloide lag zwischen ~500:1 und ~2000:125.</li>
</ol>
2. Iterative pH-Änderung und Überwachung der entsprechenden SPR-Bandenverschiebung
<ol>
	<li>Stellen Sie die Lösungstemperatur mit dem Temperiergerät des Spektralphotometers Ultraviolett-sichtbar-Nahinfrarot (UV-Vis-NIR) auf einen bestimmten Wert (z. B. 25 °C) ein.</li>
	<li>Überwachen Sie den anfänglichen pH-Wert der Probenlösung mit einem pH-Messgerät und stellen Sie ihn auf leicht unter pH 7 ein. Erfassen Sie das Absorptionsspektrum im Bereich zwischen 400 nm und 1000 nm.</li>
	<li>Ändern Sie den pH-Wert der Probe auf ~pH 4 (d. h. pH 4,0 ± 0,3), indem Sie 10 μL-Volumina von 0,1 M HCl hinzufügen und das Absorptionsspektrum zwischen 400 nm und 1000 nm sammeln.</li>
	<li>Ändern Sie den pH-Wert der Probe auf ~pH 10 (d. h. pH 10 ± 0,3), indem Sie 10 μl Volumen mit 0,1 M NaOH hinzufügen und das Absorptionsspektrum zwischen 400 nm und 1000 nm sammeln.</li>
	<li>Ändern Sie den pH-Wert zwischen pH 4 und pH 10 mit HCl und NaOH 10-mal und erfassen Sie das Absorptionsspektrum kontinuierlich bei 25 ± 0,2 °C29,30. HINWEIS: Bei allen Probenlösungen wurde die optische Dichte des Peaks des SPR-Bandes bei etwa 0,2 gehalten. Es wird eine Pufferwirkung durch die restliche Pufferlösung in einer Lösung erwartet. So wurde nach Bestätigung des Gleichgewichts der endgültige pH-Wert bestimmt. Der pH-Wert wurde direkt in einer Probenküvettenzelle mit einer Mikro-pH-Elektrode gemessen, die eine Genauigkeit von ±0,005 pH hat.</li>
	<li>Ermitteln Sie den ASCII-Datensatz (American Standard Code for Information Interchange) von Wellenlängen als Funktion der Absorption. Extrahieren Sie die durchschnittliche Position der Bandpeaks mit dem Programm "Peak Fit ".<ol>
		<li>Plotten Sie den Datensatz, um die optische Dichte als Funktion der Wellenlänge (nm) mit der Funktion Plotten anzuzeigen.</li>
		<li>Markieren Sie die anfänglichen Spitzenwellenlängen λ1, λ2 und λ3 , indem Sie ihre ungefähren Positionen in den gezeichneten Daten auswählen, und passen Sie die Daten mit der RUN-Funktion an.</li>
		<li>Erhalten Sie das Diagramm, das den zentralen Peak jedes (λi), XCi, mit der Fläche jedes Bandes (Ai) enthält.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Exportieren Sie die extrahierten Peakpositionen und -bereiche in ein Tabellenkalkulationsprogramm und berechnen Sie die durchschnittliche Peakposition bei einem bestimmten pH-Wert.<ol>
		<li>Bestimmen Sie den Gewichtungsfaktor ai jedes Peakzentrums λi , indem Sie die Fläche des Bandes (Ai) mit der Gesamtfläche der gesamten Bänder vergleichen als: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67856/67856eq01.jpg" style="margin: auto;">.</li>
		<li>Extrahieren Sie die durchschnittliche Peakposition <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67856/67856eq02.jpg" style="margin: auto;"> (pH) mit Gl. (1). 
		<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/67856/67856eq03.jpg" style="margin: auto;">(1)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Generieren Sie ein Reversibilitätsdiagramm mit dem folgenden Prozess:<ol>
		<li>Tabellarische Darstellung der durchschnittlichen Peakpositionen als Funktion jeder "Operations"-Zahl, <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67856/67856eq02.jpg" style="margin: auto;">n als <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67856/67856eq02.jpg" style="margin: auto;"> vs. n. Die Operationsnummer n für die Probe vor der Zugabe von Säure bei ~pH 7 auf 1 setzen. Erhöhen Sie die Arbeitsgangsnummer jedes Mal um 1, indem Sie den pH-Wert auf ~pH4 mit HCl oder den pH-Wert auf ~pH 10 mit NaOH ändern. Machen Sie n, um bei einem sauren Zustand (d.h. ~pH 4) gerade zu sein, und ungerade, um ein basischer Zustand (d.h. pH 10) zu sein.</li>
		<li>Analysieren Sie die Peakposition an jedem n, <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67856/67856eq02.jpg" style="margin: auto;"> (n) = λ(n), mit der Formel30 
		<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/67856/67856eq04.jpg" style="margin: auto;">(2) HINWEIS: Stellt eine anfängliche durchschnittliche Peakposition bei n = 1 durch A dar. Drücken Sie die Parameter B und C als n-abhängige Peakpositionsverschiebung aus. Legen Sie den Parameter D als Amplitude des Dämpfungsfaktors E der Wiederholung fest. Verwenden Sie die Sinusfunktion , um die Wellenförmigkeit der Peakposition als Funktion von n anzuzeigen.</li>
		<li>Transportieren Sie den Datensatz von (x, y) zur Origin-Software und plotten Sie.</li>
		<li>Bilden Sie die benutzerdefinierte Funktion, die in Gl. (2) unter Nichtlineare Kurvenanpassungsfunktion der Analyse angegeben ist. Geben Sie die Anfangswerte A, B, C, D und E ein, und klicken Sie auf RUN , um die Anpassung abzuschließen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>TEM-Bildgebung<ol>
		<li>Stellen Sie die TEM-Proben der Aβ 1-40-beschichteten 20 nm Goldkolloide mit Formvar-beschichteten Kupfergittern her. Untersuchen Sie die Proben mit einem TEM, das bei 80 kV betrieben wird.</li>
		<li>Erfassen Sie Bilder mit einer nominalen Vergrößerung von 28.000x oder 71.000x mit einer 4-Megapixel-CCD-Digitalkamera (AMT) des Modells XR-40. Erfassen Sie die TEM-Bilder für Aβ 1-40-beschichtetes 20-nm-Gold bei jeder Vorgangsnummer n = 1 (~pH 7), n = 2, 4, 6, 8 und 10 (pH 4) und n = 3, 5, 7 und 9 (pH 10).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Raman-Bildgebung und Untersuchung der reversiblen Aggregation
<ol>
	<li>100 μl Lösung werden für jede Probe mit der Arbeitsgangsnummer n auf eine Glimmerscheibe (Durchmesser 1 cm) gegeben. Trocknen Sie die Proben über Nacht, bevor Sie sie messen.</li>
	<li>Sammeln Sie Weißlichtbilder bei jeder Operation Nummer n. Bereiten Sie die separate Probe auf einer Glimmerscheibe vor, da der pH-Wert für jede Arbeitsgangnummer n kontinuierlich zwischen ~ pH 4 und ~ pH 10 geändert wurde (Abbildung 3).</li>
	<li>Erfassen Sie das Raman-Bild bei jeder Operation Nummer n mit einem Laser mit einer Wellenlänge von λ = 633 nm bei einer Leistung von 0,5 ± 0,05 mW und einer räumlichen Auflösung von ~0,43 μm in einem Gitter bestehend aus 100 × 100 Pixeln mit einer Integrationszeit von 500 ms/Spektrum für den Bereich zwischen ~200 cm-1 und ~2.800 cm-1 (Abbildung 4).</li>
	<li>Plotten Sie das repräsentative Spektrum für jedes n, ausgerichtet als Funktion von n und konstruieren Sie das dreidimensionale SERS-Spektrum als Funktion von n für Aβ1-40 beschichtetes 20-nm-Gold (Abbildung 5A). Verwenden Sie die Draufsicht des dreidimensionalen SERS-Spektrums als Konturkarte (Abbildung 5B), um die spezifischen Moden zu extrahieren, die mit einer bestimmten pH-Bedingung verbunden sind (d. h. ~pH 4 und ~pH 10). Extrahiert alle spektralen Merkmale, die entweder nur bei ngerade oder nur bei nungerade verbessert wurden.</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Amyloid-Beta-Peptid 1-40 (A&beta; 1&ndash; 40 Peptid)</td><td>r-Peptid (Bogart, GA, USA)</td><td>A-1156-2</td><td></td></tr><tr><td>CCD-Digitalkamera</td><td>AMT</td><td>XR-40 4-Megapixel CCD&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Destilliertes deionisiertes Wasser aus dem Milli-Q- Wassersystem</td><td>Millipore Sigma (Burlington, MA, USA)</td><td>Milli-Q IQ 7000</td><td></td></tr><tr><td>Gefrierschrank -86 oC</td><td>Thermo Scientific</td><td>Revco Chilly Willy&nbsp; RLE-Serie Geräte-ID 187004 Build-Nummer 40.04</td><td></td></tr><tr><td>Goldkolloid (10 nm)</td><td>Ted Pella, Inc. (Redding, Kalifornien, USA)</td><td>15703-20</td><td></td></tr><tr><td>Goldkolloid (100 nm)</td><td>Ted Pella, Inc. (Redding, Kalifornien, USA)</td><td>15711-22</td><td></td></tr><tr><td>Goldkolloid (15 nm)</td><td>Ted Pella, Inc. (Redding, Kalifornien, USA)</td><td>15704-20</td><td></td></tr><tr><td>Goldkolloid (20 nm)</td><td>Ted Pella, Inc. (Redding, Kalifornien, USA)</td><td>15705-20</td><td></td></tr><tr><td>Goldkolloid (30 nm)</td><td>Ted Pella, Inc. (Redding, Kalifornien, USA)</td><td>15706-21</td><td></td></tr><tr><td>Goldkolloid (40 nm)</td><td>Ted Pella, Inc. (Redding, Kalifornien, USA)</td><td>15707-21</td><td></td></tr><tr><td>Goldkolloid (50 nm)</td><td>Ted Pella, Inc. (Redding, Kalifornien, USA)</td><td>15708-21</td><td></td></tr><tr><td>Goldkolloid (60 nm)</td><td>Ted Pella, Inc. (Redding, Kalifornien, USA)</td><td>15709-22</td><td></td></tr><tr><td>Gold Kolloid (80 nm)</td><td>Ted Pella, Inc. (Redding, Kalifornien, USA)</td><td>15710-22</td><td></td></tr><tr><td>Hochwertigste V1AFM Glimmerscheiben 10 mm</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>#50</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure-Standardlösung, 1,0 N</td><td>Fluka</td><td>Charge# SHBB4705V&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 318949-2L</td><td></td></tr><tr><td>Makroquarz Quvette Light Path 10 mm</td><td>Fire Fly Science&nbsp;</td><td>Typ1-MC-Path10mm</td><td></td></tr><tr><td>Mikro-pH-Elektrode</td><td>HORIBA</td><td>Modell 9618S (MFG Nr. 9Y8E0050)</td><td></td></tr><tr><td>Peak Fit Program</td><td>Origin (Northampton, MA, USA)</td><td>OriginPro2018b (64-bit) b9.5.5.409 (Akademisch)</td><td></td></tr><tr><td>pH 4.00 Pufferlösung&nbsp;</td><td>VWR</td><td>Kat.-Nr. 34170-127</td><td></td></tr><tr><td>pH 7,00 Pufferlösung&nbsp;</td><td>Fisher Chemical</td><td>SB107-4 Los 191041 pH-Messgerät</td><td></td></tr><tr><td></td><td>HORIBA</td><td>Modell F-72G (MFG Nr. B27M0017)</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen &nbsp; Maxi-Tipps 1&ndash; 5 mL</td><td>Fisher&nbsp; &nbsp;</td><td>02-707-467</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen 10 mL</td><td>Fisher</td><td>02-717-135</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen 1000 mL</td><td>Fisher</td><td>02-717-156</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen 1&ndash; 200 mL</td><td>Fisher</td><td>02-717-143</td><td></td></tr><tr><td>Pipettierer Fisher Brand Elite 0.5&ndash; 5 mL</td><td>Fisher</td><td>QU05317</td><td></td></tr><tr><td>Pipettierer Fisher Brand Elite 100 1000 mL</td><td>Fisher</td><td>QU01672</td><td></td></tr><tr><td>Pipettierer Fisher Brand Elite 10 100 mL</td><td>Fisher</td><td>MU10985</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Fisher Brand Elite 1&ndash; 10 mL</td><td>Fisher</td><td>MU08178</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxidlösung 1,0 m</td><td>Fluka</td><td>Los#05096BPV&nbsp; &nbsp; 319511-2L</td><td></td></tr><tr><td>TEM</td><td>FEI Co</td><td>Morgagni Modell 268&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>TempAssure PCR-Röhrchen, flache Kappen, natur</td><td>USA Scientific</td><td></td><td>Polypropylen. 0,2 mL einzelne dünnwandige Röhrchen mit aufgesetzten mattierten Schieberkappen</td></tr><tr><td>UV-Vis-NIR Spektralphotometer</td><td>Varian</td><td>CARY 5000 UV1106M074</td><td></td></tr><tr><td>WI Tec alpha300R Konfokales Raman-Mikroskop</td><td>WITec-Oxford Instrument</td><td>XMB3000-3001</td><td></td></tr></tbody></table>

charakterisierung der ph-abhängigen reversiblen selbstorganisation von amyloid-beta-1-40-beschichteten goldkolloiden

Characterization of pH-Dependent Reversible Self-Assembly of Amyloid Beta 1-40-Coated Gold Colloids

Mit der Bindung von Aβ 1-40 an die Oberfläche der nanokolloidalen Goldpartikel verschob sich die SPR-Bande um das Absorptionsmaximum von 530 nm signifikant auf die Peakposition von ~650 nm, wenn die Lösung saurer gemacht wurde (pH 4)35. Zusammen mit TEM-Bildern haben wir festgestellt, dass spektroskopische Merkmale, die bei pH 4 beobachtet wurden, mit der Bildung der Goldkolloidaggregate mit plausibel entfalteter Konformation und Vernetzung mit den umgebenden ungefalteten Aβ 1-40-Monomeren übereinstimmen, die über die Goldoberfläche30 adsorbiert sind. Wir beobachteten, dass die Aβ 1-40-Monomere unter basischen Bedingungen (pH 10) wieder in die gefaltete Konformation zurückkehrten, was zu einer quasi-reversiblen Verformung der Aggregate führte. Dieser quasi-reversible Prozess zeigte sich an der Abwechslung des durchschnittlichen Bandenpeaks (<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67856/67856eq02.jpg" style="margin: auto;">(n)), der zwischen einer kürzeren und einer längeren Wellenlänge wechselte, und der dispergierten vs. aggregierten Morphologie in TEM-Bildern zwischen basischen (pH = 10) und sauren (pH = 4) Bedingungen. Es wurde bereits beobachtet, dass ein Teil des Aβ 1-40-Monomers auch dann noch ungefaltet bleibt, wenn die Lösung auf die Ausgangsbedingungen36 zurückgesetzt wurde. Video 1 zeigt die pH-abhängige Farbänderung von Aβ 1-40 und 20 nm blankem Goldkolloid.
Zum Vergleich wurde die pH-Hopfenuntersuchung von 20 nm blankem Goldkolloid durchgeführt (Abbildung 5C und D). Im Verlauf der pH-Änderungsoperation zeigte sich das Wachstum der Clusterisierung der Goldkolloide in SPR-Bandenshoft, TEM-Bildern sowie Weißlichtbildern. Interessanterweise gab es mehrere SERS-Spektrallinien, die entweder von nungerade und ngerade abhingen. So wurde z.B. bei ngerade (pH ~4) die Linie bei 275 cm-1, die als der mit Aun assoziierte Modus (n = 5, 6, 12, 16, 20, 58)37 oder der Modus des Au-Cl-Liganden38 zugeordnet wurde, intensiv beobachtet. Andererseits wurde auchfür n bei 1008 cm-1 C-N str39 und CH2 wag39, CH2 Deformation40 bei 1291 cm-1 extensiv beobachtet.
Im Gegensatz zu der eindeutigen pH-abhängigen und reversiblen Aggregationsmorphologie, die bei der Weißlichtbildgebung beobachtet wurde, gab es relativ subtile Unterschiede in den spektralen Merkmalen im SERS-Spektrum zwischen nungerade und ngerade. In erster Näherung war die spektrale Liniendichte im Bereich zwischen 250 cm-1 und 1750 cm-1 für nungerade höher als für ngerade. Die Spektrallinien im Fingerabdruckbereich, 1250 cm-1 und 1750 cm-1 (Amide I, II und III-Banden) für nungerade , zeigten weniger aufgelöste spektrale Merkmale, was entweder auf eine Verbreiterung oder Zunahme der spektralen Dichten hindeutet. In Abbildung 6 wurde eine Konturkarte in Abbildung 5B (Abbildung 6B) mit den SERS-Signalen bei 761 cm-1 (rot) und 1395 cm-1 (blau) organisiert, was die Betonungen bei nungerade bzw. ngerade darstellt (Abbildung 6C). Als repräsentatives SERS-Spektrum für nungerade und ngerade ist oben das SERS-Spektrum bei n = 7 (rot) und n = 4 (blau) dargestellt (Abbildung 6A). Um die Korrespondenz zur SPR-Bandenverschiebung für Aβ1-40 beschichtetes 20 nm Gold zu verdeutlichen, ist das Bandverschiebungsdiagramm in Abbildung 3 auf der Seite dargestellt (Abbildung 6D).
Während wir vorläufige Daten über die vollständige Zuordnung des beobachteten SERS-Spektrums haben, stellen wir hier einige bemerkenswerte Raman-Verschiebungsmerkmale fest. Die inn ungeraden Spektrallinien und (plausiblen Zuordnungen) verstärkten Spektrallinien liegen hauptsächlich im Bereich kleiner als 1000 cm-1: 394 cm-1 (Trp)41,42,43, 761 cm-1 (His, Ala)39,44,45,46,47, 875 cm-1 (Indol-NH-Verschiebung, C-C-Dehnung von Met)39, 974 cm-1 (Glu, C-COO- Dehnung von Asp, Modus im Zusammenhang mit Citrat)39,48,49. Die Raman-Verschiebung, die bei n verstärkt wurde, zeigtesogar signifikante spektroskopische Merkmale im Fingerabdruckbereich (Amide I, II und III): 1166 cm-1 (N-H+ Deformation von Tyr)39,41, 1227 cm-1 (Ala-Pro-Gly, Amide III)39,50,51, 1395 cm-1 (COO- symmetrische Dehnung oder CH2- CH3- Scherung von Glu)39,48, 1585 cm-1 (Ring-CC-Dehnung von Phe, asymmetrische Dehnung von Carboxylat -Au, COO-Dehnung von Citrat, Verformung von Benzolring)39,41,45,46,47,49,52, 1592 cm-1 (Phe, Tyr, C=C Dehnung von Tyr, CC-Dehnung von Ring in Phe, Benzolringdehnung und COO- Dehnung in Phe und Tyr und asymmetrische Dehnung von OH)39,41,48,50,51 und 1628 cm-1 (Amide I Subpeak, charakteristisch für intermolekulare β-Faltblattstrukturen 53, C=O und die gekoppelten CN/NH-Schwingungsmoden des Proteinrückgrats, die aus parallelen β-Faltblatt-artigen Strukturen stammen, Akkumulation von aggregiertem Aβ54, zufälligen Spulen β Windungen, β-Haarnadelkurven48. Die Sequenzen, die für nungerade odern gerade erscheinen, sind in Abbildung 7 dargestellt. Insgesamt waren für n,die sogar der reversiblen Aggregation bzw. der ungefalteten Konformation von Aβ 1-40, Phe/Tyr enthaltendem Benzolring, der symmetrische Dehnung des COO-, CH2- CH3- Scherenmodus von Glu und -NH+ Deformation von Tyr signifikant an der Konformationsänderung des Peptids beteiligt. Während der Demontage der Aggregation, die beobachtet wurde, wenn die Peptide die gefaltete Konformation annahmen, die den bei nvorherrschenden Modi entsprach, schienen Glu, Asp, Met, His und Ala beteiligt zu sein.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67856/67856fig01.jpg"> 
Abbildung 1: Die pH-abhängige Absorption und Morphologie. Gezeigt werden das Absorptionsspektrum bei pH 4 (A) und pH 10 (B) für Aβ 1-40 beschichtete Goldnanopartikel (20 nm) sowie die entsprechenden TEM-Bilder, Skizzen von Aggregations-/dispergierten Partikeln und Bilder von Lösungen in Fläschchen. A ist die ungefaltete Konformation von Aβ 1-40 Monomeren unter sauren Bedingungen, und B ist die gefaltete Konformation unter basischen Bedingungen. Diagramme von Aβ 1-40 Monomeren in jeder Konformation und Aggregations-/dispersen Morphologien sind neben den TEM-Bildern dargestellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67856/67856fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67856/67856fig02.jpg"> 
Abbildung 2: Reversibilität der von Nanogröße abhängigen Selbstorganisation. Die Verschiebung der durchschnittlichen Peakposition des SPR-Bandes <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67856/67856eq02.jpg" style="margin: auto;">in Abhängigkeit von der Operationsnummer n, für alle getesteten Größen von Goldkolloidpartikeln. Die ungefähren pH-Werte und die entsprechende Stufe der in Abbildung 1 gezeigten Zuschlagstoffe sind ebenfalls angegeben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67856/67856fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67856/67856fig03v2.jpg"> 
Abbildung 3: <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/67856/67856eq05.jpg" style="margin: auto;"> und TEM/Weißlicht-Bilder bei jeder Operationsnummer. Die <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67856/67856eq02.jpg" style="margin: auto;"> als Funktion der Operationsnummer n wurde für Aβ 1-40 beschichtetes 20 nm Gold (geschlossene Kreise) und 20 nm Goldkolloid (offene Kreise) zusammen aufgetragen und ist mit repräsentativen TEM (A und C)/Weißlichtbildern (B und D) bei ausgewählten Operationsnummern (n = 1, 2, 3, 7 und 8 durch dekodierte Pfeile gekennzeichnet) für Aβ 1-40 beschichtetes 20 nm Gold (A und B) und 20 nm Gold Kolloid (C und D). Die schwarze Schrift zeigt den pH-Wert 7 an, die blaue Schrift den pH-Wert 4 und die rote Schrift den pH-Wert 10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67856/67856fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67856/67856fig04.jpg"> 
Abbildung 4: Repräsentatives weißes Licht und Raman-Bild. Das Weißlichtbild, das Raman-Bild und das SERS-Spektrum für (A) n = 2 und (B) n = 3; i) Weißlichtbild in einem weiten Sichtfeld, ii) Weißlichtbild in dem Bereich, in dem das Raman-Bild aufgenommen wurde (gekennzeichnet durch ein rotes Quadrat in i)), iii) das Raman-Bild von zwei kombinierten Komponenten, iv) Raman-Bild von Komponente 1 und sein v) SERS-Spektrum von iv), vi) Raman-Bild von Komponente 2, und vii) SERS-Spektrum von vi). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67856/67856fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67856/67856fig05.jpg"> 
Abbildung 5: Konturkarte des SERS-Spektrums für nungerade, ngerade undn all. (A) Die dreidimensionale Karte des SERS-Spektrums im Bereich von 250 cm-1 und 1750 cm-1 als Funktion von n für Aβ1-40 beschichtetes 20-nm-Gold mit einer in (B) gezeigten Konturkarte oben. (C) Die dreidimensionale Karte des SERS-Spektrums im Bereich von 250 cm-1 und 1750 cm-1 als Funktion von n für 20 nm Gold mit einer in (D) dargestellten Konturkarte oben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67856/67856fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67856/67856fig06v2.jpg"> 
Abbildung 6: Konturkarte des SERS-Spektrums. Die Konturkarte des SERS-Spektrums als Funktion von n (1-10). (A) Extinktion bei 1395 cm-1 (blau) und 761 cm-1 (rot). (B-D) Das untere Feld zeigt das SERS-Spektrum und das rechte Feld zeigt die Amplitude der Änderung der Signalintensität von SERS-Signalen bei jedem n. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67856/67856fig06largev2.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67856/67856fig07v3.jpg"> 
Abbildung 7: Bemerkenswerte Sequenzen von Aβ1-40. Die Sequenzen, denen eine signifikante Beteiligung bei nungerade (entsprechend der Bildung der gefalteten Konformation) zugewiesen wurde, sind durch rote Pfeile nach unten gekennzeichnet, und diejenigen, denen eine signifikante Beteiligung bei ngerade (entsprechend der Bildung der ungefalteten Konformation) zugewiesen wurde, sind durch blaue Pfeile gekennzeichnet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67856/67856fig07largev3.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Video 1: pH-abhängige Farbänderung von Aβ1-40 und 20 nm Kolloid aus blankem Gold. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67856/Movie%20Abeta-Gold%20Color%20Change.wmv" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.</a>

Charakterisierung der pH-abhängigen reversiblen Selbstorganisation von Amyloid-beta-1-40-beschichteten Goldkolloiden

The characterization of A&#946;1-40 coated over the nano-gold colloidal particle surfaces was conducted using surface plasmon resonance (SPR) spectroscopy ...

characterization-ph-dependent-reversible-self-assembly-amyloid-beta-1

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Photo-induzierte Quervernetzung von unmodifizierten Proteine ​​(picup) ermöglicht die Charakterisierung des Oligomers Größenverteilung in metastabilen Protein-Mischungen. Wir zeigen, Anwendung picup zu drei Vertreter amyloidogene Peptide der 40 - und 42-Rückstand bildet der Amyloid-β-Protein und Calcitonin, und eine Kontrollgruppe Peptid Wachstumshormon-Releasing-Faktor.

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Reinigung und Aggregation des Amyloid Precursor Protein intrazelluläre Domäne

Proteine können entweder eine native Struktur annehmen oder sich in unlösliches Amyloid fehlfalten. Bedingungen, die den Fehlfaltungsweg begünstigen, führen zur Bildung verschiedener Arten von Amyloidfibrillen. Die hier beschriebenen Methoden ermöglichen eine schnelle Umwandlung von nativen Proteinen in Amyloid in vitro.

Schnelle Generierung von Amyloid aus nativen Proteinen in vitro

Wir berichten hier über eine HPLC-Reinigung Protokoll zugeschnitten, die hochreine Beta-Amyloid-42 (Aß42) und Beta-Amyloid-40 (Aβ40) Peptide, der fähig Oligomerbildung ergibt. Amyloid beta ist ein hoch Aggregation neigen, hydrophoben Peptid in Alzheimer-Krankheit in Verbindung gebracht. Die amyloidogenen Natur des Peptids macht seine Reinigung eine Herausforderung.

Ein Tailored HPLC Reinigungsprotokoll, dass die Renditen hochreine Amyloid Beta 42 und Amyloid Beta 40 Peptides, Fähig zur Oligomerbildung

Dieses Protokoll beschreibt, wie Aβ Oligomere aus einem synthetischen Peptid in Vitro vorzubereiten und relative Mengen der Aβ Oligomer durch eine Dot-Blot-Analyse zu bewerten.

A11-positiver β-Amyloid Oligomer Vorbereitung und Bewertung mit Dot-Blot-Analyse

Ein Protokoll für die Synthese von 1,2-Dithiolane modifizierte Peptid und die Charakterisierung der supramolekularen Strukturen durch das Peptid Selbstmontage.

Synthese und Charakterisierung von 1,2-Dithiolane geändert selbstorganisierende Peptide

Hier sind zwei Methoden, die einzeln oder in Kombination verwendet werden können, um die Wirkung von Beta-Amyloid auf Fibrin Gerinnsel Struktur zu analysieren. Enthalten ist ein Protokoll für die Schaffung einer in Vitro Fibrin Gerinnsel, gefolgt von Gerinnsel Trübung und Rasterelektronenmikroskopie Methoden.

Analyse der β-Amyloid-induzierte Anomalien auf Fibrin Gerinnsel Struktur von Spektroskopie und Rasterelektronenmikroskopie

Diese biochemische Reinigungsmethode mit massenspektrometriebasierter Proteomanalyse erleichtert die robuste Charakterisierung von Amyloidfibrillenkernen, was die Identifizierung von Zielen zur Vorbeugung der Alzheimer-Krankheit beschleunigen kann.

Biochemische Reinigung und proteomische Charakterisierung von Amyloid-Fibrillenkernen aus dem Gehirn

Amyloid-Fibrillen werden von zahlreichen Proteinen gebildet, und die resultierenden Fibrillen teilen eine "Kreuz-β-Blatt"-Struktur. Hier beschreiben wir, wie Amyloidfibrillenproben für die Röntgenfaserbeugung vorbereitet werden können und wie die Muster analysiert werden können.

Amyloid und die Cross-Beta-Architektur

Erfahren Sie die pH-abhängige reversible Selbstorganisation von Amyloid-beta-1-40 auf Goldkolloiden mittels SERS-Spektroskopie. Diese Methode liefert Einblicke in Proteinfaltung und Aggregationsdynamik für Alzheimer-Forschung.

Charakterisierung der pH-abhängigen reversiblen Selbstorganisation von Amyloid-beta-1-40-beschichteten Goldkolloiden

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