Isolierung und Identifizierung von Bakterienstämmen aus der Haut von terrestrischen Amphibien

Diese Forschung zielte darauf ab, ein effizientes Protokoll für die Sammlung von Hautmikrobiota von wilden terrestrischen Amphibien zu entwickeln und die mikrobielle Integrität während der Lagerung und Handhabung sicherzustellen.

Zu den wichtigsten Herausforderungen gehören die Vermeidung von Probenkontaminationen, die Aufrechterhaltung der mikrobiellen Lebensfähigkeit während der Lagerung und die Kultivierung eines langsamen Wachstums, um die Vielfalt der Mikrobiota der Amphibienhaut vollständig zu bewerten.

Es wurde festgestellt, dass mit Glycerin angereicherte Kochsalzlösung die Integrität der Mikrobiota der Amphibienhaut während der Lagerung und Handhabung, eine konsistente bakterielle Kultivierung und die Verbesserung mikrobieller Konservierungsstrategien für die ökologische und biotechnologische Forschung bewahrt.

Dieses Protokoll behebt den Mangel an standardisierten Probenahmemethoden, bewahrt und behandelt kultivierbare Amphibienhautbakterien und gewährleistet die Integrität der Gemeinschaft.

[Erzähler] Sterilisieren Sie das Medium zu Beginn, indem Sie es 15 bis 30 Minuten lang bei 121 bis 134 Grad Celsius autoklavieren. Lassen Sie das Agarmedium nach dem Autoklavieren auf etwa 45 bis 50 Grad Celsius abkühlen. Gießen Sie das abgekühlte Medium unter einer zuvor sterilisierten Laminar-Flow-Haube in sterile Petrischale. Sobald der Agar fest geworden ist, beschriften Sie die Petrischalen mit dem Mediumtyp und dem Zubereitungsdatum. Mischen Sie die aus dem Feld gewonnene Probe mit der Lösung, indem Sie den Tupfer gegen die Röhrchenwände drücken, während Sie das Röhrchen zusammendrücken und den Tupfer gründlich drehen, 10 Mal im Uhrzeigersinn und 10 Mal gegen den Uhrzeigersinn. Mischen Sie die mikrobiologische Probe vor der Verarbeitung gründlich an. Bereiten Sie die serielle Verdünnung der kutanen Probe mit Kochsalzlösung im Bereich von 10 hoch -1 bis 10 bis hoch -6 vor. 100 Mikroliter der unverdünnten Probe inokulieren und seriell verdünnen auf die vorbereiteten Agarplatten. Streichen Sie die Probe mit einer sterilen L-förmigen Schlaufe über die Oberfläche des Agarmediums, um eine gleichmäßige Verteilung ohne übermäßigen Druck zu gewährleisten. Drehen Sie die geimpften Platten um und legen Sie sie drei bis fünf Tage lang in einen Inkubator bei 20 bis 25 Grad Celsius, um das Wachstum mesophiler und psychotroper Bakterien auf der Amphibienhaut zu unterstützen. Wählen Sie nach der Inkubation Bakterienkolonien mit unterschiedlichen Morphologien für die weitere Analyse aus. Stellen Sie sicher, dass die Kolonien gut isoliert sind und unterschiedliche Erscheinungen aufweisen, z. B. Variationen in Farbe, Größe, Form, Kante, Oberfläche oder Textur. Um die ausgewählten Völker zu subkulturieren, wird ein gut isoliertes Volk von der ursprünglichen Agarplatte auf eine frische Agarplatte mit einer Impfschlaufe unter aseptischen Bedingungen übertragen. Streifen Sie die Kolonie, um sie zu isolieren. Und dann entsprechend inkubieren. Hier wird das koordinierte Probenahmeverfahren eines Speleomantes italicus-Individuums mit sterilen Werkzeugen im Feld gezeigt. Die Probenahme wurde von zwei Bedienern mit sterilen Handschuhen und Tupfern durchgeführt, um die Belastung der Amphibie zu minimieren und die Präzision bei der Handhabung zu gewährleisten. Der Tupfer wurde sofort in eine Kochsalzlösung mit 20 % Glycerin überführt, um die mikrobielle Integrität während des Transports zum Labor zu erhalten. Ein Vergleich der Dichte der mikrobiellen Gemeinschaft, die in Kochsalzlösung mit und ohne Glycerinzugabe gehalten wird, ist hier dargestellt. Die Bakterienlast bei der Lagerung von Kochsalzlösung ohne Glycerin war signifikant niedriger als bei der Kontrolle und Kochsalzlösung mit Glycerin. Die mikrobielle Gemeinschaft, die in Kochsalzlösung mit Glycerin gelagert wurde, zeigte eine ähnliche bakterielle Belastung wie die Kontrolle, was auf die Erhaltung der mikrobiellen Integrität hinweist. Die beste Konservierung der mikrobiellen Gemeinschaft wurde in Kochsalzlösung mit Glycerin beobachtet, das bei vier Grad Celsius gelagert wurde und die stabilste bakterielle Belastung im Laufe der Zeit aufweist. Die Lagerung in Kochsalzlösung allein bei Raumtemperatur führte zu dem höchsten Bakterienwachstum, was auf eine mikrobielle Kontamination oder selektive Förderung bestimmter Bakteriengruppen hinweist. Das Gefrieren bei minus 20 Grad Celsius reduzierte die Bakterienbelastung, was darauf hindeutet, dass sich niedrige Temperaturen negativ auf das Überleben der Mikroben auswirkten.