Analyse von Thrombozyten-Subpopulationen durch Mehrfarben-Durchflusszytometrie

Unsere Forschung verwendet die Mehrfarben-Durchflusszytometrie zur Identifizierung und Charakterisierung von Thrombozyten-Subpopulationen, mit dem Ziel, die Rollen, Aktivierungsmuster und klinische Relevanz bei Thrombosen, Entzündungen und krankheitsspezifischen Kontexten zu verstehen. Der etablierte mehrfarbige durchflusszytometrische Assay ermöglichte es, die zu beobachten, dass ein Thrombozytenagonist ein ausgeprägtes Aktivierungsmuster induziert und im Vergleich zu einem kollagenverwandten Peptid ein Prokoagulans und eine Subpopulation erzeugt. Der mehrfarbige Assay ermöglicht die gleichzeitige Messung der Thrombozytenaktivierung, Adhäsion, Aggregation und des apoptotischen Potenzials eines einzelnen Blutplättchens innerhalb einer Population isolierter menschlicher Blutplättchen in einem einzigen Röhrchen.

[Dozent] Bereiten Sie zunächst alle für den Eingriff erforderlichen Reagenzien vor. Mische nun 10 Milliliter 10x Tyrode-Puffer mit 90 Millilitern destilliertem Wasser. Fügen Sie 0,1 Gramm Glukose hinzu und stellen Sie den pH-Wert des vollen Volumens mit Hepes auf 7,4 ein. Stellen Sie zuerst den pH-Wert von 10 Millilitern des Puffers auf 7,4 ein und stellen Sie dann den pH-Wert der restlichen 90 Milliliter mit einer normalen Salzsäure auf 6,5 ein. Bereiten Sie für die Blutentnahme für jeden Spender eine 10-Milliliter-Spritze mit zwei Millilitern ACD-Antikoagulans vor. Lassen Sie die Spritze bei Raumtemperatur äquilibrieren. Nachdem Sie das Spenderblut in einer vorgewärmten ACD-Spritze entnommen haben, überführen Sie das mit ACD behandelte Blut langsam in ein 15-Milliliter-Reaktionsröhrchen. Zentrifugieren Sie das mit ACD behandelte Blut bei 209 g für 20 Minuten bei Raumtemperatur, ohne die Pause zu verwenden. In der Zwischenzeit werden 25 Milliliter Tyrodes Hepes-Puffer mit einem pH-Wert von 6,5 in einem 50-Milliliter-Reaktionsröhrchen hergestellt. Nach der Zentrifugation wird die obere plättchenreiche Plasmaschicht vorsichtig in das Röhrchen mit dem Tyrode-Hepes-Puffer übertragen. Um eine Kontamination zu vermeiden, lassen Sie etwa einen Milliliter plättchenreiches Plasma über dem Buffy-Coat und der Erythrozytenschicht. Zentrifugieren Sie dann die Suspension bei 430 g 10 Minuten lang bei Raumtemperatur, um die Blutplättchen zu pelletieren. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Plättchenpellet vorsichtig in 200 bis 300 Mikrolitern Tyrode-Puffer, eingestellt auf einen pH-Wert von 7,4. Messen Sie die Thrombozytenzahl mit einem Zellzähler, bevor Sie sie mit dem Hepes-Puffer von Tyrode bei einem pH-Wert von 7,4 auf 200.000 Blutplättchen pro Mikroliter einstellen. Für Rezeptoren, die vor der Färbung nicht aktiviert werden müssen, einschließlich CD61, CD42B, CD41, CXCR7 und CXCR4, bereiten Sie eine ungefärbte und eine gefärbte Probe pro Antikörper vor. Für Rezeptoren oder Marker, die aktiviert werden müssen, wie z. B. PAC-1, CD63, CD62P, NXN5 und Zombie-NIR. Aktivieren Sie die Probe mit 10 Mikrogramm pro Milliliter CRPXL und bereiten Sie sowohl aktivierte als auch nicht aktivierte Proben vor. Um die Blutplättchen zu aktivieren, inkubieren Sie sie 30 Minuten lang mit 10 Mikrogramm pro Milliliter CRPXL. Inkubieren Sie dann das isolierte Blutplättchen mit unterschiedlichen Konzentrationen des Fluorochrom-konjugierten Antikörpers oder sterben Sie 30 Minuten lang. Geben Sie dann 300 Mikroliter Anexin-Bindungspuffer zu jeder Probe, um sie zu verdünnen. Messen Sie 10.000 Ereignisse für jede Probe mit einem Durchflusszytometer. Berechnen Sie den Färbeindex für jeden Antikörper, um die optimale Trennung zwischen positiven und negativen Populationen zu bestimmen. Plotten Sie den Färbeindex gegen die Antikörperkonzentrationen, um die optimale Konzentration für jeden Antikörper zu ermitteln. Für die Färbung lösen Sie Hämenpulver in 1,4 M Natriumhydroxid auf, um eine 3M-Lösung herzustellen. Erhitzen Sie die Lösung fünf Minuten lang bei 450 Umdrehungen pro Minute auf 96 Grad Celsius. Verdünnen Sie es mit destilliertem Wasser, um eine drei Millimolare Stiellösung zu erhalten. Nachdem Sie die Thrombozytenzahl auf 1 Million Blutplättchen pro Probe eingestellt haben, aktivieren Sie die Blutplättchen wie zuvor gezeigt. Geben Sie 43,3 Mikroliter Antikörpercocktail zu jeder Probe und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln. Nach der Inkubation verdünnen Sie jede Probe mit 300 Mikrolitern eines X und X in einem Bindungspuffer aus 10 Millimolar Hepes-Natriumhydroxid bei pH 7,4. Messen Sie jede gefärbte Probe sofort mit dem Durchflusszytometer. Für die Kompensation mit Kügelchen bereiten Sie 150 Mikroliter PBS für jedes Fluorophor vor und fügen Sie einen Tropfen Kügelchen und einen Mikroliter des Fluoreszenzkonjugierten Antikörpers hinzu. Um Annexin V zu kompensieren, verwenden Sie PECY7B mit sieben Kügelchen, die mit Anti-Human-CD 62L markiert sind, die an dasselbe Fluorophor wie Annexin V konjugiert sind. Verwenden Sie aminreaktive Kompensationskügelchen für den Amin-Reaktivfarbstoff, indem Sie zwei Tropfen positive Kügelchen und einen Tropfen negative Kügelchen in 150 Mikrolitern PBS mit einem Mikroliter Matrize mischen. Vergewissern Sie sich, dass die positiven Kügelchen reagieren und ein Signal anzeigen, die negativen Kügelchen jedoch nicht. Bereiten Sie eine Fluoreszenz minus eine Kontrolle für jeden Marker vor. Die Streudiagramme zeigten eine deutliche Verschiebung der Thrombozytenpopulation. Mit Hämin, das mehr Blutplättchen mit geringer Vorwärtsstreuung als andere Agonisten bildet. Die Behandlung mit ADP-Thrombin und CRPXL führte dazu, dass 40 bis 60 % der Blutplättchen CD42-positiv waren, während Hämin diese Population signifikant reduzierte. Alle Thrombozytenagonisten hatten keinen Einfluss auf die Oberflächenexpression von CD41 und CD61. Nur Hemen erhöhte die Oberflächenexpression von CXCR4 und CXCR7 signifikant. Darüber hinaus war die Phosphatidylserin-Exposition auch unter der Hämin-Behandlung erhöht, was zu einer Erhöhung der Annexin-V-positiven Zellen führte. UMAP- und Phenolgraphenanalysen definierten 27 verschiedene Thrombozytencluster, die je nach Agonistentyp variierten. Hemin verursachte die dramatischste Verschiebung der Cluster-Muster. Ruhende Thrombozyten-Subpopulationen waren am stärksten mit ADP konserviert und mit Hämin vermietet.