Verabreichung von flüchtigen Anästhetika an Zebrafischlarven zur Verhaltensbeobachtung

Unsere Forschung konzentriert sich auf die Anästhesiepharmakologie, die ein Interesse an anästhetischen Mechanismen sowie den Mechanismen von anästhetischen Nebenwirkungen umfasst. Die Verwendung von Zebrafischlarven als Verhaltensmodell zur Untersuchung der Anästhesiepharmakologie nimmt schnell zu und hat viele Vorteile, einschließlich ihrer Eignung für den Einsatz in groß angelegten Screening-Experimenten. Der Vergleich von flüchtigen und intravenösen Anästhetika bleibt eine Herausforderung, da die Verabreichung von flüchtigen Anästhetika an Nicht-Wassertiere viel einfacher ist als intravenöse Anästhetika.

Im Gegensatz dazu lassen sich intravenöse Anästhetika leichter an Wassertiere verabreichen als flüchtige Anästhetika. Dieses Protokoll bietet ein relativ kostengünstiges und zugängliches Mittel zur Verabreichung flüchtiger Anästhetika in einer geschlossenen Kammer, um Verhaltensexperimente an Zebrafischlarven durchzuführen. Andere Protokolle dieser Art erfordern oft eine Form von maßgeschneiderten Geräten, die kostspielig oder für diejenigen nicht ohne weiteres zugänglich sein können, die nicht über die Mittel verfügen, diese Art von Ausrüstung zu erstellen oder zu erwerben.

Legen Sie zunächst eine 0,5 Millimeter dicke Silikonfolie auf eine saubere, ebene Fläche. Untersuchen Sie die Blätter auf Falten und vermeiden Sie diese, wenn möglich. Reinigen Sie die Laken mit 70% Alkohol, um Öl oder Schmutz zu entfernen.

Wenn die Folie vollständig trocken ist, verwenden Sie einen Applikator, z. B. einen Pinsel, um eine dünne, gleichmäßige Schicht Haftgrundierung auf die Silikonplatte aufzutragen. Sobald die Klebegrundierung aufgetragen ist, richten Sie das doppelseitige Klebeband mit der Silikonfolie aus, wobei die Papierunterlage nach oben zeigt. Tragen Sie das Klebeband nach und nach mit einer Rolle auf das Silikon auf, um die Oberfläche zu glätten und Luftblasen zu entfernen.

Tragen Sie die Grundierung nach Bedarf in kleinen Abschnitten erneut auf und setzen Sie das Klebeband fort, während die Grundierung in ein bis fünf Sekunden trocknet. Drehen Sie die Silikonfolie um, um mit der Silikonseite nach oben zu arbeiten, um Luftblasen sichtbar zu machen und zu entfernen. Schneiden Sie anschließend das selbstklebende Silikon in mindestens 10 Millimeter breite Streifen.

Stellen Sie sicher, dass die Streifen lang genug sind, um mindestens die Breite einer Reihe der Well-Platte abzudecken. Um die flüchtigen Anästhetika vorzubereiten, geben Sie ein Volumen des nichtflüchtigen Lösungsmittels in ein HPLC- oder Szintillationsfläschchen, um einen minimalen Kopfraum zu gewährleisten, sobald die endgültige Verdünnung des flüchtigen Anästhetikums hinzugefügt wird. Verwenden Sie eine gasdichte Hamilton-Spritze, um das flüchtige Anästhetikum hinzuzufügen und das Fläschchen schnell zu verschließen.

Mischen Sie die Fläschchen je nach Bedarf durch Vortexen oder Beschallung. Lagern Sie sie vorübergehend, während Sie Zebrafischplatten zubereiten. Um das Verhaltensexperiment durchzuführen, setzen Sie eine Zebrafischlarve fünf Tage nach der Befruchtung in jede zweite Reihe einer 96-Well-Glasplatte um.

Entfernen Sie vorsichtig die E-3-Lösung aus jeder Vertiefung. Verwenden Sie eine Transferpipette, um jede Vertiefung in der Reihe mit der experimentellen Lösung zu füllen. Drücken Sie den Streifen mit den selbstklebenden Silikonstreifen schnell nach unten, um Blasenbildung und Fische zu verhindern, die in benachbarte Brunnen überlaufen.

Drücken Sie dann fest auf die Oberseite der Platte, um sicherzustellen, dass jede Vertiefung versiegelt ist. Wiederholen Sie den Versiegelungsvorgang, bis die Lösung ausgetauscht und alle Vertiefungen in jeder zweiten Reihe der Platte versiegelt sind. Drehen Sie die Platte vorsichtig um und untersuchen Sie sie auf Luftblasen.

Legen Sie die Platte mit der Silikonkleberseite nach unten in die Verhaltensbeobachtungseinheit und führen Sie das Verhaltensexperiment durch. In den versiegelten Vertiefungen wies die Konzentration von Sevofluran über drei Stunden einen minimalen Verlust auf, und Isofluran zeigte eine Abnahme der Konzentration um 4 %. Keines der beiden Anästhetika zeigte in den ersten 30 bis 60 Minuten einen signifikanten Verlust.

Die mediane effektive Konzentration für Sevofluran betrug 62 Mikromolar für spontane Bewegung und 126 Mikromolar für ausgelöste Bewegung, wobei die Leiter deutlich niedriger war als die zuvor berichteten 240 Mikromolaren, was auf eine Verbesserung bei der Herstellung einer gasdichten Abdichtung mit dieser Methode zurückzuführen sein könnte. Es wurde ein signifikanter Unterschied in der spontanen Bewegung zwischen offenen und verschlossenen Vertiefungen beobachtet, der nach zwei Stunden auftrat, wahrscheinlich aufgrund der Erschöpfung des Sauerstoffs in der Vertiefung, und ist eine wichtige Einschränkung dieser Technik.