Name: Heteromultizelluläre Stromazellen in gerüstfreien 3D-Kulturen von Epithelkarzinomzellen treiben die Invasion voran (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-04T14:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Erfahren Sie eine kostengünstige Methode zur Erstellung von 3D-Zellkulturen mit und ohne Gerüst zur Untersuchung heterozellulärer Interaktionen in Brust- und Bauchspeicheldrüsenkrebs. Dieses Protokoll ermöglicht die Quantifizierung von Zellinvasion und Verhalten in Tumorsphäroiden.

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</ol>

<table><tbody><tr><td>15 mL Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen&nbsp; &nbsp;</td><td>Falke&nbsp;</td><td>14-959-53A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>96-Well, behandelte Mikroplatte mit U-förmigem Boden&nbsp;</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>12566432&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>100 mm mit Schalenzellkultur behandelte Oberfläche&nbsp;</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>130182&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>170 L CO2-Inkubatoren&nbsp;</td><td>VWR</td><td>VWR51014991(10810902)</td><td></td></tr><tr><td>200 Selbstdichtende Pipettenspitzen</td><td>mit Barriere Fisher Scientific</td><td>02-682-255</td><td></td></tr><tr><td>500 mL DMEM/Schinken F-12, [+] L-Glutamin</td><td>Corning</td><td>10-090-CV</td><td></td></tr><tr><td>1000 Selbstdichtende Pipettenspitzen mit Barriere</td><td>Molecular Biology Products Inc.</td><td>2179HR</td><td></td></tr><tr><td>Tierversuchsfreie rekombinante humane EGF</td><td>PeproTech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>Automatisierter Pipetten-Repeater E3x</td><td>Eppendorf</td><td>4987000410</td><td></td></tr><tr><td>Basalmembranlösung</td><td>Huntsman Cancer Institute&nbsp;</td><td>https://healthcare.utah.edu/huntsmancancerinstitute/</td><td></td></tr> <tr><td>Bead Bath</td><td>Labor-Rüstung&nbsp;</td><td></td><td></td>74300706</tr><tr><td>Biorender&nbsp;</td><td>Biorender</td><td>Biorender.com&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Laminar-Flow-Werkbänke für biologische Sicherheit&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>300590389</td><td></td></tr><tr><td>BioSpa 8 Automatisierter Inkubator&nbsp;</td><td>Agilent&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td>23082120</tr><tr><td>Zellzähler&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAF2000</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger für die Zellzählkammer</td><td>Thermo Scientific</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Deep Red&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>Nr. C34565&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge&nbsp;</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>13100675</tr><tr><td>Choleratoxin B Untereinheit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9903-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Combitips advanced, steril, 5,0 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-683-714</td><td></td></tr><tr><td>Zytation 10&nbsp; Reader Imager</td><td>Agilent&nbsp;</td><td></td><td></td>2105245</tr><tr><td>Definierter Trypsin-Inhibitor</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>R007100&nbsp;</td><td>Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor in 1x PBS</td></tr><tr><td>Spender Pferdeserum, 500 mL, Herkunft USA</td><td>Corning</td><td>35-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modifiziertes Eagle's Medium&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>10-013-CV&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Excel-Software&nbsp;</td><td>Microsoft Office 365&nbsp;</td><td></td><td></td>https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel</tr><tr><td>Fötales Rinderserum&nbsp;</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>26140079&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum, qualifiziert, US-Herkunft</td><td>Thermo Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicinsulfat, flüssiges</td><td>Corning</td><td>30-005-CR</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortison-Lösung, 50 & Mikro; M, sterilfiltriert, BioXtra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6909-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Image J Software&nbsp;</td><td>Fidschi&nbsp;</td><td>https://imagej.net/ij/</td><td></td></tr> <tr><td>Insulinlösung human</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Lupe&nbsp;</td><td>Fisher Wissenschaftlich&nbsp;</td><td>01-182-392&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugen-Röhrchen&nbsp;</td><td>Costar&nbsp;</td><td>3621&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>CKX53SF</td><td></td></tr><tr><td>Mini Lightbox&nbsp;</td><td>Fisher Wissenschaftlich&nbsp;</td><td>361044708&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Molekulare Sonden CellTracker Blue CMAC Farbstoff</td><td>Fisher Wissenschaftlich&nbsp;</td><td>C2110&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Molekulare Sonden CellTracker Orange CMRA Farbstoff&nbsp;</td><td>Fisher Wissenschaftlich&nbsp;</td><td>Nr. C34551&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Lösung</td><td>Cytiva</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Lösung&nbsp;</td><td>Cytiva&nbsp;</td><td>SV30010&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Phasenkontrast-Mikroskop&nbsp;</td><td>Echo&nbsp;</td><td></td><td></td>RVSF1000</tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung&nbsp;</td><td>Fisher Wissenschaftlich&nbsp;</td><td>SH3025601&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pipettensteuerung</td><td>Corning</td><td>4099</td><td></td></tr><tr><td>Pipette 100 &ndash; 1.000 &micro; L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>Pipette 20 &ndash; 200 & micro; L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000055</td><td></td></tr><tr><td>Prism&nbsp;</td><td>GraphPad Software</td><td>https://www.graphpad.com/features</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 mit L-Glutamin und 25 mM HEPES</td><td>Corning</td><td>10-041-CV</td><td></td></tr><tr><td>Serologische Pipette, 10 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>170356N</td><td></td></tr><tr><td>Serologische Pipette, 25 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>170357N</td><td></td></tr><tr><td>Serologische Pipette, 5 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>170355N</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau-Lösung, 0,4%&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>25900CI&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA, 0,25%&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>25053CI&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

heteromultizelluläre stromazellen in gerüstfreien 3d-kulturen von epithelkarzinomzellen treiben die invasion voran

Heteromulticellular Stromal Cells in Scaffold-free 3D Cultures of Epithelial Cancer Cells to Drive Invasion

In dieser Studie haben wir ein Zellkultursystem entwickelt, um heteromultizelluläre 3D-Sphäroide zu erzeugen, die aus Epithel- und Stromazellen mit organoidähnlicher Morphologie bestehen. Sphäroide wurden durch Plattieren von 2.000 Epithelzellen unter Monokulturbedingungen etabliert. Unter Co-Kulturbedingungen von zwei Zelltypen wurden Sphäroide durch Plattieren von 1.000 Epithelzellen und 1.000 Stromazellen etabliert. Unter Co-Kulturbedingungen von drei Zelltypen wurden Sphäroide etabliert, indem 1.000 Epithelzellen und zwei verschiedene Stromazelltypen mit 500 Zellen jedes Zelltyps plattiert wurden. Vor der Etablierung von Sphäroiden können Zellen mit fluoreszierenden Zell-Tracker-Farbstoffen gefärbt werden, die eine Überwachung der räumlichen Organisation der Zellen ermöglichen. Nach 24 Stunden der anfänglichen Sphäroidbildung umfassen nachgelagerte Anwendungen pharmakologische Störungen, Bildgebung und Probenentnahme. Die Zeitraffer-Bildgebung ist nützlich für die Beurteilung von Veränderungen des Sphäroidverhaltens und der Morphologie, einschließlich der Fläche und der Zirkularität (Abbildung 1A). 24 Stunden nach der Beschichtung können Sphäroide in eine Gerüstumgebung eingebettet werden, und die Zeitrafferbildgebung kann verwendet werden, um das Auftreten invasiver Strukturen aus dem Sphäroid zu beurteilen (Abbildung 1B). Die Entnahme von heteromultizellulären Sphäroidproben hat viele Anwendungen, einschließlich genomischer und proteomischer Profilerstellung auf globaler und Einzelzellebene durch experimentelle Techniken wie RNA-Sequenzierung, Einzelzell-RNA-Sequenzierung, Proteomsequenzierung und zyklische Immunfluoreszenz.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67902/67902fig01.jpg"> 
Abbildung 1: Schematische Darstellung des 3D-Zellkulturprozesses und möglicher Anwendungen. (A) Die Zellsuspension von Epithelzellen mit nicht-epithelialen Stromazellen wird in ultraniedrige 3D-Anhaftungsplatten pipettiert, um Sphäroide zu bilden. Sphäroide werden durch Hellfeldmikroskopie alle 24 h über 96 h abgebildet. Zelllinien können mit fluoreszierenden Zell-Tracker-Farbstoffen für die nachgeschaltete Weitfeldmikroskopie gefärbt werden, bevor sie die Sphäroidbildung induzieren , oder sie können pharmakologisch nach der Sphäroidbildung gestört werden. Sphäroidparameter wie Morphologie, Fläche, Zirkularität und Organisation können analysiert werden. (B) Sphäroide von Epithelzellen und Epithelzellen mit Stromazellen werden unter Verwendung des Protokolls von A gebildet. Sphäroide wurden durch Plattieren von 2.000 Epithelzellen unter Monokulturbedingungen etabliert. Unter Co-Kulturbedingungen von zwei Zelltypen wurden Sphäroide durch Plattieren von 1.000 Epithelzellen und 1.000 Stromazellen etabliert. Unter Co-Kulturbedingungen von drei Zelltypen wurden Sphäroide etabliert, indem 1.000 Epithelzellen und zwei verschiedene Stromazelltypen mit 500 Zellen jedes Zelltyps plattiert wurden. Nach 24 Stunden wird eine gerüstartige Basalmembran-Extraktlösung überlagert, und die Bilder werden alle 24 Stunden für 120 Stunden in der Hellfeldmikroskopie aufgenommen. (C) Etablierte gerüstfreie und gerüstbasierte hetero-multizelluläre 3D-Kulturen können für eine Vielzahl von Downstream-Anwendungen wie zyklische Immunfluoreszenz, Einzelzell-RNA-Sequenzierung und Einzelzell-Proteomik verwendet werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67902/67902fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Die Monokultur-Sphäroide MCF10A, MCF10Ca1h und BT-474 behalten einen kompakten sphärischen Phänotyp für bis zu 96 Stunden nach der Beschichtung bei. Bei der Co-Kultivierung mit mikrovaskulären Endothelzellen von EA.hy926, BJ-5ta-Fibroblasten und/oder THP-1-Monozyten-ähnlichen Zellen entwickelten die Sphäroide zelluläre Ausstülpungen an der Peripherie, die nach 96 h stärker ausgeprägt wurden (Abbildung 2A-C). Wichtig ist, dass diese Vorsprünge, Knospungen und Verdichtungsphänomene von Sphäroiden Variationen der zellulären Organisation des Krebssphäroids und der co-kultivierten Stromazellen darstellen, die mit der 3D-Invasivität nach Zugabe eines auf Basalmembranbasis basierenden Hydrogels wie Matrigel korrelierten. Die Morphologie der Knospe reichte von festen bis hin zu lockeren Zellaggregaten, die der Morphologie von Organoiden ähnelten. Im Gegensatz dazu erschienen MDA-MB-468-Monokultur-Sphäroide als große, lose Zellaggregate. Wenn MDA-MB-468-Zellen jedoch mit EA.hy926, BJ-5ta und/oder THP-1 cokultiviert wurden, bildeten sie kompakte Sphäroide (Abbildung 2D).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67902/67902fig02.jpg"> 
Abbildung 2: Die Bandbreite der Architekturen und Morphologien, die von Kombinationen von nicht-epithelialen Stromazellen in Kombination mit epithelialen Tumor-/Nicht-Tumorzellen in gerüstfreien 3D-Kulturen angenommen werden. Repräsentative Hellfeldbilder von (A) MCF10A, (B) MCF10Ca1h, (C) BT-474, (D) MDA-MB-468 Sphäroiden in Monokultur oder in Co-Kultur mit stromalen BJ-5ta-Fibroblasten/Ea.hy926 mikrovaskulären Endothelzellen oder Ea.hy926/THP-1 Monozyten-ähnlichen Zellen oder BJ-5ta/THP-1 Zellen über 96 Stunden. Jedes Sphäroid wurde durch die Beschichtung von 2.000 Zellen gebildet. Sphäroide wurden unter Monokulturbedingungen aus 2.000 Epithelzellen gebildet. Sphäroide wurden unter Co-Kulturbedingungen aus 1.000 Epithelzellen und zwei verschiedenen Stromazelltypen von 500 Zellen gebildet. Die Bildung von knospenden oder aggregierten organoidähnlichen Strukturen wurde unter sphäroiden Co-Kulturbedingungen 24 h nach der Beschichtung in MCF10A-, MCF10Ca1h- und BT-474-Epithelzellen initiiert. Die Verdichtung von MDA-MB-468-Zellen wurde unter Sphäroid-Co-Kulturbedingungen 25 h nach der Plating beobachtet. Maßstabsleisten = 100 μm. Abkürzung: hpp = Stunden nach dem Plattieren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67902/67902fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
72 Stunden nach der Beschichtung zeigten MCF10A-, MCF10Ca1h- und BT-474-Zellen, die mit EA.hy926 und THP-1 oder mit BJ-5ta und THP-1 kokultiviert wurden, eine signifikante Zunahme der Sphäroidfläche im Vergleich zu epithelialen Sphäroiden in Monokulturen. MCF10Ca1h zeigte auch eine signifikante Zunahme des Sphäroidbereichs, wenn es mit EA.hy926 und BJ-5ta co-kultiviert wurde. Das Auftreten von knospenden Strukturen in co-kultivierten Sphäroiden führte zu einer signifikanten Abnahme der Sphäroid-Zirkularität für MCF10A, MCF10Ca1h und BT-474, die mit EA.hy926 und THP-1 oder mit BJ-5ta und THP-1 kokultiviert wurden. Ähnliche Effekte wurden für BT-474 beobachtet, das sowohl mit EA.hy926 als auch mit BJ-5ta cokultiviert wurde (Abbildung 3A,B). Im Gegensatz dazu zeigten MDA-MB-468-Zellen, die mit EA.hy926 und BJ-5ta, EA.hy926 und THP-1 oder BJ-5ta und THP-1 kokultiviert wurden, eine signifikante Abnahme der Sphäroidfläche im Vergleich zu Monokultur-MDA-MB-468-Sphäroiden; es gab jedoch keinen Einfluss auf die Zirkularität (Abbildung 3A,B).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67902/67902fig03.jpg"> 
Abbildung 3: Diagramme zur Flächen- und Zirkularitätsanalyse von monokulturellen und heteromultizellulären stromalen 3D-Kulturen ohne Gerüste 72 Stunden nach der Beschichtung. (A) Durchschnittliche Fläche (cm 2) und (B) durchschnittliche Zirkularität von MCF10A, MCF10Ca1h, BT-474 und MDA-MB-468 in monokulturellen und heteromultizellulären stromalen Sphäroidkulturen 72 Stunden nach der Beschichtung. Die gemeldeten Daten sind repräsentativ für mindestens drei unabhängige biologische Replikate und werden, sofern nicht anders angegeben, als technische Replikatmittelwerte ± SEM angegeben. *, **, *** oder **** stellen p-Werte &lt; 0,05, 0,01, 0,001 bzw. 0,0001 dar, sofern nicht anders angegeben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67902/67902fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Die Anwendung des Zelltracker-Farbstoffs auf BT-474-tumorigene Epithelzellen und Stromazellen vor der Etablierung der Sphäroiden zeigte, dass Stromazellen, einschließlich EA.hy926 und BJ-5ta, die knospenden Strukturen am Rand der zentralen BT474-Sphäroide bildeten (Abbildung 4, Ergänzendes Video S1, Ergänzendes Video S2, Ergänzendes Video S3 und Ergänzendes Video S4). 48 Stunden nach der Platingierung zeigen einzelne Weitfeld-Fluoreszenzbilder von Sphäroiden, die mit Fibroblasten kokultiviert wurden, dass Fibroblasten-Sphäroide zusammen mit Endothelzellen kolokalisierten, aber nicht mit BT-474-Sphäroiden. Es wurde auch festgestellt, dass eine Minderheit der Endothelzellen unter Co-Kulturbedingungen mit BT-474-Sphäroiden kolokalisiert. Dies deutet darauf hin, dass die Anordnung der Stromazellen innerhalb des Sphäroids mit einer organoidartigen Morphologie korreliert.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67902/67902fig04.jpg"> 
Abbildung 4: Weitfeld-Fluoreszenz-Standbilder von differentiell gefärbten Stroma- und BT-474-Zellen in heteromultizellulären 3D-Kulturen 48 Stunden nach der Beschichtung. BT-474-Sphäroide werden mit dem Fluoreszenzfarbstoff Blue Cell Tracker gefärbt. BJ-5ta-Fibroblasten sind mit orangefarbenem Zelltracker-Farbstoff gefärbt, der in roter Farbe dargestellt ist. Ea.hy926 Endothelzellen werden mit tiefrotem Zelltracker-Farbstoff gefärbt, der in grüner Farbe dargestellt ist. Jedes Sphäroid wurde durch die Beschichtung von 2.000 Zellen gebildet. Sphäroide wurden unter Monokulturbedingungen aus 2.000 Epithelzellen gebildet. Sphäroide unter Co-Kulturbedingungen (BT-474/BJ-5ta, BT-474/Ea.hy926) wurden unter Verwendung von 1.000 Epithelzellen und 1.000 Stromazellen gebildet. Sphäroide in Doppel-Co-Kultur (BT-474/BJ-5ta/Ea.hy926) wurden unter Verwendung von 1.000 Epithelzellen und 500 Zellen jedes Stromazelltyps gebildet. Die Abbildungen sind repräsentativ für mindestens drei biologische Replikate. Maßstabsleiste = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67902/67902fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Um die biologische Relevanz unseres organoiden Sphäroidmodells zu beurteilen, wurden die Sphäroide 24 h nach der Beschichtung mit Basalmembran-Extraktlösung überlagert. Monokultur-BT-474-Sphäroide zeigten 120 h nach der Beschichtung keine invasiven Eigenschaften. BT-474-Sphäroide, die mit BJ-5ta oder EA.hy926 kokultiviert wurden, entwickelten jedoch Strukturen an der Peripherie des Sphäroids, die in die Umgebung der Gerüst-Basalmembran-Extraktlösung eindrangen. Die Anzahl und Länge dieser Protrusionen war in BT-474-Sphäroiden, die sowohl mit BJ-5ta als auch mit EA.hy926 kokultiviert wurden, um 48 h bis 120 h nach der Plattierung signifikant erhöht (Abbildung 5, Ergänzendes Video S5, Ergänzendes Video S6, Ergänzendes Video S7 und Ergänzendes Video S8).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67902/67902fig05.jpg"> 
Abbildung 5: Hellfeld-Standbilder von BT-474-Zellen in heteromultizellulären 3D-Kulturen mit Basalmembran-Extrakt-Lösungs-Overlay 5 Tage nach dem Overlay. Jedes Sphäroid wurde durch die Beschichtung von 2.000 Zellen gebildet. Die Basalmembran-Extraktionslösung wurde 24 Stunden nach der Beschichtung über Sphäroide gelegt. Sphäroide wurden unter Monokulturbedingungen aus 2.000 Epithelzellen gebildet. Sphäroide unter Co-Kulturbedingungen (BT-474/BJ-5ta und BT-474/Ea.hy926) wurden unter Verwendung von 1.000 Epithelzellen und 1.000 Stromazellen gebildet. Sphäroide in Doppel-Co-Kultur (BT-474/BJ-5ta/Ea.hy926) wurden unter Verwendung von 1.000 Epithelzellen und 500 Zellen jedes Stromazelltyps gebildet. (A) Invasive Strukturen, die aus dem Krebssphäroid herausragen, das in Basalmembran-Extraktlösung eingebettet ist, können unter Co-Kulturbedingungen beobachtet werden. (B) Qualifizierung der invasiven Protrusionszahl zum Zeitpunkt 48 hpp. (C) Qualifizierung der invasiven Protrusionslänge zum Zeitpunkt 48 hpp. Die Abbildungen sind repräsentativ für mindestens drei biologische Replikate. Maßstabsleiste = 200 μm. Abkürzung: hpp = Stunden nach dem Plattieren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67902/67902fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzendes Video S1: BT-474 Monokultur-Sphäroid mit blauem Farbstoff des Cell Trackers. BT-474 (2.000) Zellen wurden in einer 96-Well-Mikroplatte mit U-förmigem Boden und ultrageringer Bindung resuspendiert, um Sphäroide zu bilden. Eine Überlappung von Hellfeld- und Weitfeld-Fluoreszenzbildern wurde über 48 h aufgenommen. Abkürzung: ULA = ultralow attachment. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67902/Supplementary%20Video%201.1.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.</a>
Ergänzendes Video S2: BT-474-Sphäroide, die mit BJ-5ta-Fibroblasten kokultiviert wurden. BT-474 (1.000) und 1.000 BJ-5ta-Fibroblasten wurden in ULA-Platten resuspendiert, um Sphäroide zu bilden. BT-474-Zellen wurden mit dem blauen Farbstoff des Zelltrackers und BJ-5ta-Fibroblasten mit dem orangefarbenen Farbstoff des Zelltrackers inkubiert. Eine Überlappung von Hellfeld- und Weitfeld-Fluoreszenzbildern (blau = BT-474, rot = BJ-5ta) wurde über 48 h aufgenommen. Abkürzung: ULA = ultralow attachment. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67902/Supplementary%20Video%201.2.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.</a>
Ergänzendes Video S3: BT-474-Sphäroide, die mit Ea.hy926-Endothelzellen kokultiviert wurden. BT-474 (1.000) und 1.000 Ea.hy926 Endothelzellen wurden in ULA-Platten resuspendiert, um Sphäroide zu bilden. BT-474-Zellen wurden mit dem blauen Farbstoff des Cell Trackers und Endothelzellen von Ea.hy926 mit dem tiefroten Farbstoff des Cell trackers inkubiert. Eine Überlappung von Hellfeld- und Weitfeld-Fluoreszenzbildern (blau = BT-474, grün = Ea.hy926) wurde über 48 h aufgenommen. Abkürzung: ULA = ultralow attachment. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67902/Supplementary%20Video%201.3.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.</a>
Ergänzendes Video S4: BT-474-Sphäroide, die mit BJ-5ta-Fibroblasten und Ea.hy926-Endothelzellen kokultiviert wurden. BT-474 (1.000), 500 BJ-5ta-Fibroblasten und 500 Ea.hy926-Endothelzellen wurden in ULA-Platten resuspendiert, um Sphäroide zu bilden. BT-474-Zellen wurden mit dem blauen Farbstoff des Zelltrackers inkubiert. BJ-5ta-Fibroblasten und Ea.hy926-Endothelzellen wurden mit dem orangefarbenen Farbstoff des Zelltrackers bzw. dem tiefroten Farbstoff inkubiert. Eine Überlappung von Hellfeld- und Weitfeld-Fluoreszenzbildern (blau = BT-474, rot = BJ-5ta, grün = Ea.hy926) wurde über 48 h aufgenommen. Abkürzung: ULA = ultralow attachment. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67902/Supplementary%20Video%201.4.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.</a>
Ergänzendes Video S5: BT-474 Monokultur-Sphäroid in Basalmembran-Extraktlösung. BT-474-Zellen (2.000) wurden in ULA-Platten resuspendiert, um Sphäroide zu bilden, und die Sphäroide wurden 24 Stunden nach der Beschichtung in eine Basalmembranlösung eingebettet. Hellfeldbilder wurden über 60 h aufgenommen. Abkürzung: ULA = ultralow attachment. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67902/Supplementary%20Video%202.1.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.</a>
Ergänzendes Video S6: BT-474-Sphäroide, cokultiviert mit BJ-5ta-Fibroblasten in Basalmembran-Extraktlösung. BT-474 (1.000) und 1.000 BJ-5ta-Fibroblasten wurden in ULA-Platten resuspendiert, um Sphäroide zu bilden, und die Sphäroide wurden 24 Stunden nach der Beschichtung in eine Basalmembran-Extraktlösung eingebettet. Hellfeldbilder wurden über 60 h aufgenommen. Abkürzung: ULA = ultralow attachment. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67902/Supplementary%20Video%202.2.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.</a>
Ergänzendes Video S7: BT-474-Sphäroide, cokultiviert mit Ea.hy926-Endothelzellen in Basalmembran-Extraktlösung. BT-474 (1.000) und 1.000 Ea.hy926 Endothelzellen wurden in ULA-Platten resuspendiert, um Sphäroide zu bilden, und die Sphäroide wurden 24 Stunden nach der Beschichtung in eine Basalmembran-Extraktlösung eingebettet. Hellfeldbilder wurden über 60 h aufgenommen. Abkürzung: ULA = ultralow attachment. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67902/Supplementary%20Video%202.3.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.</a>
Ergänzendes Video S8: BT-474-Sphäroide, kokultiviert mit BJ-5ta-Fibroblasten und Ea.hy926-Endothelzellen in Basalmembran-Extraktlösung. BT-474 (1.000), 500 BJ-5ta-Fibroblasten und 500 Ea.hy926-Endothelzellen wurden in ULA-Platten resuspendiert, um Sphäroide zu bilden, und die Sphäroide wurden 24 Stunden nach der Beschichtung in eine Basalmembran-Extraktlösung eingebettet. Die Hellfeldbilder wurden über 60 Stunden aufgenommen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67902/Supplementary%20Video%202.4.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.</a>

Heteromultizelluläre Stromazellen in gerüstfreien 3D-Kulturen von Epithelkarzinomzellen treiben die Invasion voran

Breast cancer is the second leading cause of cancer-related death among women in the U.S. Organoid models of solid tumors have been shown to faithfully ...

heteromulticellular-stromal-cells-scaffold-free-3d-cultures

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Eine einfache Methode ist für die Analyse von Auswirkungen von Fibroblasten aus dem Bindegewebe auf verbundene Epithelzellen beschrieben. Die Kombination dieser Verfahren und dreidimensionalen Gewebekultur Analyse von Zellen nach der Isolierung aus 3D zu erleichtern. Die Technik ist für Zellen unterschiedlicher maligne Potential, so dass systematische Untersuchung der Wirkungen von Tumor-assoziiertem Stroma auf Tumorzellen.

Isolierung von Brustepithelzellen aus dreidimensionalen Mixed-Zelle Spheroid Co-Kultur

Heterotypische Dreidimensionale<em&gt; In Vitro</em&gt; Modellierung von Stromal-Epithelial Interaktionen beim Eierstockkrebs Initiation und Progression

Dieses Video beschreibt die Technik, eine native Matrix zu verwenden, um die Invasion von Tumorzellen zu untersuchen. Die in diesem Assay verwendete Technik bietet die Möglichkeit, epithelial-mesenchymale Zellinteraktionen in einer 3D-Umgebung zu bewerten, ohne dass eine synthetische oder fremde Matrix erforderlich ist.

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Quantifizierung der Brustkrebs-Zelle Invasivität Mit einem Drei-dimensionale (3D) Modell

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Dreidimensionale Co-Kultur-Modell für Tumor-Stroma-Interaktion

Diese Methode bewertet die Invasion von Krebszellen von Sphäroiden in eine umgebende 3D-Matrix.  Sphäroide werden über die Methode der hängenden Tropfenkultur erzeugt und dann in eine Matrix eingebettet, die aus Basalmembranmaterialien und Kollagen vom Typ I besteht.  Die Invasion aus den Sphäroiden wird anschließend überwacht.

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Der vorgestellte Ansatz bewertet gleichzeitig die Krebszellinvasion in 3D-Sphäroid-Assays und t-Zell-Zytotoxizität. Sphäroide werden in einem gerüstfreien Agarose-Multi-Mikrowell-Guss erzeugt. Co-Kultur und Einbettung in Typ I Kollagenmatrix werden innerhalb des gleichen Geräts durchgeführt, das Krebszellinvasion und T-Zell vermittelte Zytotoxizität zu überwachen ermöglicht.

Überwachung der Krebszellinvasion und T-Zell-Zytotoxizität in der 3D-Kultur

Die Invasion ist ein wichtiges biologisches Phänomen bei der Entstehung und dem Fortschreiten von Krebs. Dieser Prozess wird durch nicht-neoplastische Zellen und Bestandteile der Tumormikroumgebung beeinflusst. Das Ziel dieser Arbeit ist es, eine alternative Methode zur Analyse der Tumorzellinvasion in vitro mit Hilfe von dreidimensionalen (3D) Kulturen zu beschreiben.

Alternative Strategie zur Analyse der in vitro Zellinvasion von 3D-Kulturen

Erfahren Sie eine kostengünstige Methode zur Erstellung von 3D-Zellkulturen mit und ohne Gerüst zur Untersuchung heterozellulärer Interaktionen in Brust- und Bauchspeicheldrüsenkrebs. Dieses Protokoll ermöglicht die Quantifizierung von Zellinvasion und Verhalten in Tumorsphäroiden.

Heteromultizelluläre Stromazellen in gerüstfreien 3D-Kulturen von Epithelkarzinomzellen treiben die Invasion voran

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